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文檔簡介
1、目的:
開發(fā)能治療應(yīng)激誘導(dǎo)的雄性性功能減退的藥物。
方法:
1. 急性束縛應(yīng)激對睪丸間質(zhì)細(xì)胞功能的影響
建立束縛應(yīng)激動物模型,對照組(6只),試驗(yàn)組:束縛應(yīng)激0h組(6只),束縛應(yīng)激0.5h組(6只)、束縛應(yīng)激1h組(6只)、束縛應(yīng)激3h組(6只)、束縛應(yīng)激6h組(6只);
睪丸內(nèi)注入糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU486,并將24只大鼠分成4組:對照組,睪丸注入RU486的非應(yīng)激組,應(yīng)激組和睪
2、丸注入RU486的應(yīng)激組;
Q-PCR檢測垂體和睪丸中基因的表達(dá)情況;
Western blot法檢測StAR蛋白和類固醇合成酶的水平;
放射免疫法測定體內(nèi)類固醇激素的水平。
2. 脫氫表雄酮(DHEA)對手術(shù)應(yīng)激抑制雄性大鼠睪酮產(chǎn)生的拮抗作用
動物急性應(yīng)激模型的建立:①非DHEA處理組:對照組(6只)、手術(shù)應(yīng)激組0h(6只)、手術(shù)應(yīng)激組1h(6只)、手術(shù)應(yīng)激3h(6只)、手術(shù)應(yīng)激6h(
3、6只);②DHEA處理組:大鼠在手術(shù)應(yīng)激前1分鐘灌胃5mg/kg劑量DHEA,然后分為對照組(6只)、手術(shù)應(yīng)激組0h(6只),手術(shù)應(yīng)激組1h(6只)、手術(shù)應(yīng)激3h(6只)、手術(shù)應(yīng)激6h(6只);
分離睪丸間質(zhì)細(xì)胞和肝臟細(xì)胞;
DHEA刺激睪丸間質(zhì)細(xì)胞和肝臟細(xì)胞的11β-HSD1氧化酶活性的檢測;
DHEA抑制上述細(xì)胞的11β-HSD1還原酶活性的檢測;
Q-PCR檢測睪丸、垂體中基因的表達(dá)情況;<
4、br> 放射免疫法測定體外類固醇激素的水平。
3. 化學(xué)合成3類能抑制11β-HSD1的DHEA樣的姜黃素衍生物
化學(xué)合成3類DHEA樣的單羰基姜黃素衍生物;
檢測3類DHEA樣的單羰基姜黃素衍生物的生物活性,研究對人肝臟和大鼠睪丸微粒體中11β-HSD1氧化還原酶的影響。
結(jié)果:
1.1 束縛應(yīng)激過程,應(yīng)激大鼠血清皮質(zhì)醇水平比對照組明顯增加,而血清LH水平變化不明顯,然而,應(yīng)激3-6
5、小時(shí)后大鼠血清睪酮水平顯著低于對照組。
1.2 從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示,束縛應(yīng)激不能抑制基礎(chǔ)睪酮生產(chǎn),但顯著地抑制LH、22R-OH膽固醇和LH加22R-OH膽固醇介導(dǎo)的睪酮合成。
1.3 RU486能使應(yīng)激介導(dǎo)的抑制睪酮生產(chǎn)恢復(fù)。
1.4 Q-PCR結(jié)果顯示,束縛應(yīng)激1小時(shí)之后,Scarb1(P<0.001),Star(P<0.01)和Cyp17a1(P<0.05)明顯下調(diào);其他類固醇生成基因,包括類固醇合成酶C
6、yp11a1(P<0.01),Hsd3b1(P<0.05)和Hsd17b3(P<0.001),以及LH受體Lhcgr(P<0.001),在應(yīng)激3小時(shí)后顯著下調(diào);應(yīng)激6小時(shí)后,大多數(shù)基因的表達(dá)水平持續(xù)降低(Lhcgr, Scarb1,Star, Cyp11a1,Hsd3b1,Cyp17a1,Hsd17b3)。而應(yīng)激時(shí)垂體Lhb、Gnrh、雌激素受體(Esr1)和Nr3c1水平無改變。
1.5 Western blot結(jié)果顯示,應(yīng)
7、激1、3、6小時(shí)的StAR蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05,P<0.05,P<0.001)。在應(yīng)激的第一個(gè)小時(shí)內(nèi),膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Scarb1和Star)(圖6)和類固醇合成酶(Cyp17a1,圖7)顯著下降,隨后類固醇合成酶(Cyp11a1,Hsd3b1和Hsd17b3)也顯著下降。與對照組相比,CYP17A1蛋白的表達(dá)(圖7)在應(yīng)激1、3小時(shí)后有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05,P<0.001)。HSD3B1蛋白的表達(dá)在應(yīng)激1、3小時(shí)后有統(tǒng)計(jì)學(xué)差
8、異(P勻小于0.05),HSD17B3的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖7)。
1.6 類固醇合成酶活性結(jié)果顯示,應(yīng)激1到6小時(shí)StAR蛋白水平和CYP17A1活性顯著下調(diào)。在應(yīng)激3小時(shí)內(nèi)HSD3B1活性降低。
2.1 與手術(shù)對照組相比,在手術(shù)應(yīng)激前1分鐘口服5mg/kg的DHEA,拮抗手術(shù)介導(dǎo)的睪酮水平下降及Star、Hsd3b1、Cyp17a1的mRNA表達(dá)下降。5mg/kg劑量對手術(shù)應(yīng)激組的Lhcgr, Scarb1,St
9、ar, Cyp11a1,Hsd3b1,Cyp17a1,Hsd17b3,Insl3的mRNA水平有明顯增加作用(圖8)。但是,DHEA處理對垂體的基因表達(dá)無影響(圖9)。
2.2 DHEA刺激睪丸間質(zhì)細(xì)胞的11β-HSD1氧化酶活性,對肝細(xì)胞的11β-HSD1氧化酶活性無影響。DHEA抑制睪丸間質(zhì)細(xì)胞的11β-HSD1還原酶活性,抑制肝細(xì)胞的11β-HSD1還原酶活性。
2.3 手術(shù)誘導(dǎo)應(yīng)激后1、3、6小時(shí)后,血清皮質(zhì)
10、醇水平顯著增加,而應(yīng)激后3、6小時(shí)開始,血清睪酮水平顯著降低。
3.1 刺激11β HSD1氧化酶活性和抑制還原酶活性以戊烷二烯酮類似物的還原酶活性顯著。
結(jié)論:
急性束縛應(yīng)激能引起大鼠機(jī)體糖皮質(zhì)激素顯著升高,使睪酮水平明顯下降;而糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU486能逆轉(zhuǎn)應(yīng)激誘導(dǎo)糖皮質(zhì)激素升高引起的睪酮的下降。DHEA能激活11βHSD1氧化酶活性和抑制還原酶活性,從而使有活性的糖皮質(zhì)激素水平下降而使睪酮水平恢
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