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文檔簡介
1、類固醇激素是動物體內(nèi)膽固醇重要的代謝產(chǎn)物,在調(diào)控動物的各種生理學功能中發(fā)揮十分重要的作用。脫氫表雄酮(Dehydroepiandro sterone,DHEA)是膽固醇代謝在腎上腺和性腺組織中重要的中間產(chǎn)物之一。本實驗室前期研究表明,DHEA可明顯調(diào)節(jié)成年和老年雄性大鼠體內(nèi)各種類固醇激素的含量及類固醇代謝關(guān)鍵酶的表達,尤其明顯促進動物機體內(nèi)雄激素和雌激素的分泌。但是關(guān)于在雌性成年動物體內(nèi)性腺組織的生物轉(zhuǎn)化規(guī)律還不清楚。卵巢是雌性動物體內(nèi)
2、甾體類激素的主要內(nèi)分泌器官,其中大部分性激素(雌激素、雄激素和孕激素)的合成主要是由卵泡內(nèi)的顆粒細胞和膜細胞完成。在腎上腺和卵巢組織中,雄激素的主要合成步驟為β-HSD催化DHEA轉(zhuǎn)化為Δ4-雄烯二酮,17β-HSD進而使Δ4-雄烯二酮轉(zhuǎn)化為睪酮;而雌激素主要是由經(jīng)顆粒細胞中的Aromatase催化睪酮和雄烯二酮轉(zhuǎn)化生成雌二醇和雌酮,由芳香化酶催化的這一步是雌激素合成的主要限速階段。DHEA對雌性動物各種生理學機能的調(diào)節(jié)作用,尤其是對女
3、性內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)及在維持健康狀態(tài)中所起的作用引起了人們的廣泛關(guān)注。已有研究表明,DHEA發(fā)揮其生學物功能主要是通過在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性類固醇激素,但DHEA在雌性動物體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化規(guī)律、其生物轉(zhuǎn)化的主要靶組織均還不是很清楚,代謝轉(zhuǎn)化過程中這三種類固醇激素合成酶在成年雌性大鼠體內(nèi)中的變化如何,動態(tài)生物轉(zhuǎn)化以及消長關(guān)系的研究很少,具體的調(diào)控機制如何,目前尚未完全明了。因此,本文以正常和去卵巢成年雌性大鼠為研究對象,探討DHEA對雌性大鼠體內(nèi)各種類
4、固醇激素含量及特定靶組織中關(guān)鍵酶基因表達的影響;并采用機械分離法分離培養(yǎng)原代大鼠卵巢顆粒細胞,研究DHEA在特定的靶細胞中的生物轉(zhuǎn)化及關(guān)鍵酶表達規(guī)律的變化,旨在揭示DHEA在正常生殖期雌性動物體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化模式和細節(jié),以期為促進動物健康養(yǎng)殖和人類相關(guān)疾病的防控提供理論依據(jù)。
1.脫氫表雄酮對雌性大鼠體內(nèi)類固醇激素含量及其代謝途徑關(guān)鍵酶表達的影響
本實驗以正常成年雌性大鼠為研究對象,探討外源性DHEA對雌性大鼠體內(nèi)的類固
5、醇激素含量及腎上腺和卵巢中相關(guān)類固醇激素代謝關(guān)鍵酶mRNA水平的影響。實驗選用清潔級雌性SD大鼠70只,隨機分對照組和DHEA處理。處理組一次性按25mg/kg·WB灌胃DHEA(溶解于10% DMSO中),對照組灌胃等量的DMSO溶液。各處理組分別于灌胃后0h,3h,6h,12h,24h和48 h宰殺大鼠,收集血清待測,收集腎上腺和卵巢-80℃保存。用放射免疫法測血清中雄烯二酮,雌二醇,睪酮,孕酮,皮質(zhì)醇,醛固酮含量變化;Realti
6、me-PCR法檢測卵巢和腎上腺3β-HSD、17β-HSD和Aromatase mRNA表達水平。試驗結(jié)果表明,與對照組相比,DHEA處理后血清雄烯二酮在3-12h內(nèi)均極顯著升高(P<0.01),12-48 h內(nèi)均顯著升高(P<0.05)其含量在3h達到最大值,較同時間點的對照組增加了165%;血清睪酮含量在DHEA處理后3-6 h極顯著高于對照組(P<0.01),其含量也在3h達到最大值,較同時間點的對照組增加了8000%。血清雌二醇
7、含量則在DHEA處理后的6h極顯著升高(P<0.01),且達到最大值,較同時間點的對照組增加了113%,雌酮和孕酮含量在48 h內(nèi)均無顯著變化。與對照組相比,DHEA處理后血清皮質(zhì)醇含量在3h顯著升高(P<0.05),而后逐漸降低,在24 h則顯著低于對照組(P<0.05);血清醛固酮含量在6h顯著升高(P<0.05)。類固醇激素代謝關(guān)鍵酶mRNA表達分析結(jié)果表明,與對照組相比,DHEA處理后腎上腺組織中3β-HSD和17β-HSD m
8、RNA表達水平在3-12 h顯著升高(P<0.05),而Aromatase mRNA表達水平在DHEA處理后的3h和12h顯著高于對照組(P<0.05);在卵巢組織中DHEA處理后3β-HSD mRNA表達水平在3和12h極顯著下降(P<0.01),6h顯著下降(P<0.05);17β-HSD mRNA表達水平僅在12h極顯著低于對照組(P<0.01),而Aromatizes mRNA表達水平在3h極顯著降低(P<0.01),6h極顯著
9、升高(P<0.01),12h再次極顯著降低(P<0.01),之后在24-48 h再次極顯著上升(P<0.01),其在3-12 h內(nèi)變化趨勢與腎上腺中Aromatase mRNA表達趨勢正好相反。
以上結(jié)果提示,外源性DHEA可以顯著升高正常雌性大鼠體內(nèi)的雄激素(雄烯二酮和睪酮)、雌激素(雌二醇)和腎上腺皮質(zhì)激素(皮質(zhì)醇和醛固酮)的含量;DHEA在雌性大鼠體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化主要是優(yōu)先向雄激素而不是雌激素轉(zhuǎn)化,且其主要是通過促進腎上腺
10、3β-HSD和17β-HSD的mRNA表達促使其向雄激素轉(zhuǎn)化。
2.脫氫表雄酮對去卵巢大鼠體內(nèi)類固醇激素含量及其代謝途徑關(guān)鍵酶的影響
本試驗以去卵巢大鼠為研究對象,探討DHEA對去卵巢大鼠血清中類固醇激素含量及腎上腺中代謝關(guān)鍵酶表達水平的影響。試驗選用30只清潔級雌性大鼠,隨機分為假手術(shù)組(SO)、去卵巢模型組(OVX-control)和DHEA+去卵巢處理組(OVX+DHEA)。DHEA處理組一次性按25mg/kg
11、·WB DHEA(溶解于10% DMSO中)灌胃,其余兩組灌胃等量的DMSO溶液,并于處理6h后處死大鼠,采集血清和腎上腺保存,待測。試驗結(jié)果表明,與SO組比較,OVX-control組血清雌二醇、孕酮和雌酮含量均顯著降低(P<0.05);而血清雄烯二酮類、睪酮、皮質(zhì)醇和醛固酮的含量則無顯著性變化(P>0.05)。與OVX-control組相比,OVX+DHEA處理組血清雄烯二酮和睪酮含量極顯著升高(P<0.01);而血清雌二醇、雌酮、
12、孕酮、皮質(zhì)醇和醛固酮的含量則無顯著性變化(P>0.05)。腎上腺類固醇激素代謝關(guān)鍵酶的mRNA表達變化分析結(jié)果表明,與SO組比較,3β-HSDmRNA表達水平顯著升高(P<0.05),而17β-HSD和Aromatase mRNA表達水平則無顯著變化(P>0.05);與OVX-control組比較,OVX+DHEA處理組3β-HSD mRNA表達水平極顯著升高(P<0.01),17β-HSDmRNA表達水平顯著升高(P<0.05),而A
13、romatase mRNA表達水平則極顯著降低(P<0.01)。
以上結(jié)果提示,外源性DHEA可以顯著升高去卵巢大鼠體內(nèi)的雄激素(雄烯二酮和睪酮)的含量,而對雌激素(雌二醇、雌酮和孕酮)和腎上腺皮質(zhì)激素(醛固酮和皮質(zhì)醇)的含量沒有明顯的影響,且其對雄激素含量影響的主要機制是通過促進腎上腺3β-HSD和17β-HSD的mRNA表達,抑制Aromatase mRNA的表達水平實現(xiàn)的。
3.脫氫表雄酮對原代大鼠顆粒細胞激素
14、生成和代謝關(guān)鍵酶的影響
探討脫氫表雄酮對原代大鼠卵巢顆粒細胞激素生成及相關(guān)甾體生成酶的影響。采用機械法分離法分離原代大鼠卵巢顆粒細胞進行體外分離培養(yǎng)。先以梯度濃度(0、0.1、1.0、10、100μmol/L)加入DHEA,確定適合繼續(xù)研究的DHEA濃度;放射免疫法檢測并對比實驗組(DHEA)和空白對照組培養(yǎng)上清液中孕酮和睪酮的濃度;Real-time PCR法檢測類固醇代謝途徑中3β-HSD、17β-HSD、Aromatas
15、e mRNA的表達變化。試驗結(jié)果表明,10μmol/L DHEA處理48 h后可極顯著促進大鼠卵巢顆粒細胞雌二醇、孕酮和睪酮的分泌量(P<0.01),顯著促進3β-HSD(P<0.01)和17β-HSD(P<0.05) mRNA的表達,Aromatase mRNA有降低的趨勢,但沒有明顯變化。
以上試驗結(jié)果提示,外源性DHEA能直接作用于原代大鼠卵巢顆粒細胞,通過作用于3β-HSD、17β-HSD、Aromatase mRNA
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