膠原三股螺旋重疊蛋白1(CTHRC1)促進結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)作用機制的研究.pdf

1、背景和目的：
　　 結(jié)直腸癌是我國第4位最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年上升和逐漸年輕化的趨勢，而導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因則是腫瘤的轉(zhuǎn)移。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的、多步驟的、多階段的過程，每個階段都受多種基因或者蛋白的調(diào)節(jié)，其中最重要的改變就是腫瘤細胞運動行為和運動能力的增強，這也是是其侵襲和轉(zhuǎn)移必不可少的。腹膜轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌比較常見的轉(zhuǎn)移方式，有文獻報道約13％的結(jié)直腸癌患者會發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移，在首次手術(shù)時發(fā)現(xiàn)有腹膜轉(zhuǎn)移的幾率

2、大約有7％，另有4％～19％的結(jié)直腸癌患者在根治術(shù)后也會出現(xiàn)腹膜轉(zhuǎn)移。腹膜轉(zhuǎn)移的發(fā)生使結(jié)直腸癌患者預(yù)后很差，只有5～9個月的中位生存期，因此，篩查結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物學標記物不僅對早期診斷及判斷預(yù)后具有重要意義，而且有利于闡明結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的分子機理，還能為臨床診治、藥物篩選及預(yù)后判斷提供新的靶點。
　　 隨著人類基因組計劃(Human genome project)的實施和分子生物學有關(guān)學科的迅猛發(fā)展，越來越多的動植物、微

3、生物基因組序列得以測定，基因序列數(shù)據(jù)正在飛速的迅速增長?；蛐酒ㄓ址QDNA芯片、生物芯片）技術(shù)就是順應(yīng)這一科學發(fā)展要求的產(chǎn)物?；蛐酒捎谄渚哂懈咚俣取⒏咄?、集約化和低成本的特點，被廣泛用于胰腺癌卵巢癌、乳腺癌、胃癌以及結(jié)直腸癌等不同癌組織差異表達基因的篩查。同樣，在結(jié)直腸癌原發(fā)灶和肝臟、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶之間也存在著大量差異表達的基因，但腹膜轉(zhuǎn)移組織和原發(fā)腫瘤組織中有哪些基因存在表達差異，國內(nèi)外報道甚少。因此，借助于基因芯片技術(shù)比較結(jié)直

4、腸癌原發(fā)腫瘤組織與腹膜轉(zhuǎn)移組織全基因組mRNA表達水平的差異，就可以找到結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因。
　　 為此，我們采用基因芯片技術(shù)比較4對結(jié)直腸腺癌原發(fā)腫瘤組織和與之配對的腹膜轉(zhuǎn)移組織全基因組表達水平的差異，通過倍數(shù)法確定差異表達的基因，并對這組基因進行功能注釋聚類分析。我們通過對腫瘤進展相關(guān)的功能類中基因的分析，探討結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移的分子機制。由于基因芯片技術(shù)有一定的假陽性率，因此我們對部分基因芯片技術(shù)篩選出的差異表達基因

5、進行RT-PCR驗證。根據(jù)以上實驗結(jié)果，我們最終確定膠原三股螺旋重復(fù)蛋白1(Collagen TripleHelix Repeat Containing1，CTHRC1)可能與結(jié)直腸癌腹膜種植轉(zhuǎn)移相關(guān)，作為下一步試驗的目的基因。
　　 CTHRC1最早是在篩查大鼠球囊損傷動脈和正常動脈之間差異基因的時候發(fā)現(xiàn)的，在大鼠成纖維細胞隨著CTHRC1表達量的提高運動能力也相應(yīng)提高。在許多人類實體癌中也有CTHRC1高表達的報道。最近在有

6、一些研究也主要集中在CTHRC1和消化道腫瘤之間的關(guān)系，比如食管癌、胃癌和腸癌等。CTHRC1是wnt蛋白的輔助因子，他能通過穩(wěn)定wnt蛋白與他在胞膜上受體的結(jié)合從而發(fā)揮選擇性激活wnt/pcp通路的作用。Wnt/pcp通路的激活使得他的下游小鳥苷三磷酸酶(small GTPases)的活性增強，尤其是Rac1和RhoA。Ras GTPases超家族包含了Rho GTPases亞群，在所有的RhoGTPases中，對Rac1(Ras-r

7、elatedC3 botulinum toxin substrate),Cdc42(cell division cycle42) and RhoA(Rashomolo-gous member A)的研究最為廣泛。Rac1的激活主要促進癌細胞的遷移和浸潤，RhoA的激活主要降低癌細胞間粘附能力，促進癌細胞的遷移和轉(zhuǎn)移。
　　 MiRNAs是廣泛存在的，大小約21～25個堿基的非編碼微小RNA，他們通過與目的基因的信使RNA3'非翻

8、譯區(qū)結(jié)合而抑制基因表達來發(fā)揮作用。MiRNAs與目的基因的信使RNA3'非翻譯區(qū)的相互作用可以導(dǎo)致目的基因信使RNA翻譯被抑制或者降解。已有大量文獻報道m(xù)iRNA在人類癌癥中有異常表達，miRNA通過靶定促癌或者抑癌基因，發(fā)揮著類似腫瘤抑制因子或者促癌因子的作用。另有研究進一步證明miRNA與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移也有關(guān)系，這一發(fā)現(xiàn)為腫瘤轉(zhuǎn)移的診斷和治療提供了新的切入點。目前關(guān)于miR-520家族的的研究并不是很多，對其主要主要研究成果集中在

9、了乳腺癌。有文獻指出miR-520d在乳腺癌中與HER2/nue受體有相互作用的關(guān)系。還有文獻指出miR-520c在乳腺癌中由于可以調(diào)控TGF-β和NF-κB通路，在乳腺癌的發(fā)展過程中起到一個抑癌基因的作用。在其他癌癥組織中尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)miR-520d的報道。
　　 因此本文的研究目的是明確CTHRC1在結(jié)直腸癌中的表達特性，探討CTHRC1促進結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的機制，初步探討對miR-520d與CTHRC1在結(jié)直腸癌中關(guān)系。

10、>　　 方法及結(jié)果：
　　 （一）基因芯片篩查差異表達基因2009年6月到2010年4月在中國廣州南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院手術(shù)治療結(jié)直腸腺癌伴腹膜種植轉(zhuǎn)移病人4例，術(shù)中收集原發(fā)腫瘤組織和腹膜轉(zhuǎn)移組織標本，浸泡于于RNA Later中常溫保存。應(yīng)用Trizol法提取總mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后經(jīng)體外擴增合成aRNA后用Cy3熒光分子標記，標記后與人類全基因組表達譜芯片雜交，待芯片完全干燥后，利用掃描儀(LuxScan3.0

11、，北京博奧)進行掃描，掃描后將圖像轉(zhuǎn)化為基于熒光強度的數(shù)字信號(GenePix Pro6.0)，隨后進行數(shù)據(jù)分析和處理。采用倍數(shù)法（≥2或≤0.5）確定配對標本間差異表達基因，通過DAVID(The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)分析工具對這組差異表達基因進行基因功能的注釋和基因富集分析，篩選出與腫瘤進展相關(guān)的功能類，在這些功能類中挑選差異

12、倍數(shù)較高且參與多個功能類的基因進行半定量熒光RT-PCR驗證。根據(jù)試驗結(jié)果及文獻報道最后決定將膠原三股螺旋重疊蛋白1(collagen triple helix repeat containing1，CTHRC1)作為繼續(xù)研究的對象。
　　 （二）基因CTHRC1生物學功能的初步探討
　　 1.基因CTHRC1對結(jié)直腸癌細胞生物功能的影響
　　 1.1 Western Blot檢測SW480, SW620, HC

13、T116, LS174, HT29，和LOVO這6種人結(jié)直腸癌細胞株中CTHRC1的蛋白表達含量。以GAPDH為內(nèi)參照物，將Western Blot的結(jié)果照片用Gelpro32軟件進行分析，以條帶的光密度值(IOD)作為對應(yīng)條帶的表達量。將目的條帶和內(nèi)參照的光密度值比較出來的倍數(shù)值用單因素方差分析進行統(tǒng)計。結(jié)果顯示在這6組細胞中CTHRC1蛋白表達量差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。最高的是HCT116，9.2127±0.486，最

14、低的是SW480，1.455±0.21。因為SW480（1.455±0.21）和SW620（5.224±0.053）具有相似的遺傳背景而且轉(zhuǎn)移潛能不相同，選這兩株細胞作為作為下一步試驗的細胞。
　　 1.2 免疫印跡檢測CTHRC1轉(zhuǎn)染效率將GV287空載體（對照組，NC）和GV287-CTHRC1重組載體分別轉(zhuǎn)染SW480，SW620細胞，Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CTHRC1基因后的SW480，SW620細胞中

15、CTHRC1的蛋白表達較對照組升高。
　　 1.3 CTHRC1對結(jié)直腸癌細胞生物學特性的影響
　　 1.3.1 CCK-8法觀察在過表達CTHRC1之后細胞增殖速度明顯下降:SW480細胞CTHRC1過表達組和對照組細胞增殖數(shù)具有統(tǒng)計學意義的差異出現(xiàn)在第四天(P=0.001)，增殖和時間的交互效應(yīng)具有統(tǒng)計學差異(F=16.528，P＜0.001)，過表達組和對照組組內(nèi)細胞增殖能力組間差異具有顯著性(P＜0.001);

16、SW620過表達組和對照組的統(tǒng)計學差異出現(xiàn)在第3天(P=0.004)細胞生長時間水平差異具有顯著性（F=2529.379，P＜0.001），增殖和時間的交互效應(yīng)具有統(tǒng)計學差異(F=26.086，P＜0.001)，過表達組和對照組組內(nèi)細胞增殖能力組間差異具有顯著性(P＜0.001)
　　 1.3.2 克隆形成實驗顯示:在過表達CTHRC1之后細胞平均克隆形成率下降，SW480細胞組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）;SW620

17、細胞組間差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.001)。
　　 1.3.3 細胞體外侵襲實驗:SW480、SW620細胞CTHRC1過表達組和對照組組間遷移能力差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001; P＜0.001);SW480、SW620細胞時間與細胞組間交互效應(yīng)差異有統(tǒng)計學意義(F=69.452，P＜0.001;F=117.365，P＜0.001)。兩組細胞間同一天測得數(shù)據(jù)經(jīng)單因素方差分析SW480、SW620均在第二天開始有統(tǒng)計學差異

18、(P＜0.001，P＜0.001)。
　　 1.3.4 劃痕試驗檢測細胞遷移能力:SW480細胞CTHRC1過表達組劃痕愈合能力強于對照組(P=0.041)。
　　 2.基因CTHRC1在結(jié)直腸癌組織中的表達及臨床意義
　　 2.1 收集2003年1月～2009年6月間廣州南方醫(yī)院普外科行手術(shù)治療的結(jié)直腸腺癌伴腹膜轉(zhuǎn)移病人的組織蠟塊，腫瘤原發(fā)組織蠟塊標本57塊，腹膜轉(zhuǎn)移組織蠟塊標本30塊，另外從數(shù)據(jù)庫中選取5年隨

19、訪期內(nèi)無腹膜轉(zhuǎn)移發(fā)生的病人原發(fā)腫瘤蠟塊標本54塊，作為對照組。免疫組化方法驗證CTHRC1在結(jié)直腸癌蠟塊組織中的表達，用平均光密度值代表CTHRC1蛋白表達強度。
　　 2.2 CTHRC1主要在胞漿內(nèi)表達，伴有腹膜轉(zhuǎn)移的原發(fā)癌組、腹膜轉(zhuǎn)移組和不伴有腹膜轉(zhuǎn)移的原發(fā)組組蛋白表達量分別是0.25±0.04，0.26±0.04和0.19±0.03，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，而且伴有腹膜轉(zhuǎn)移的原發(fā)癌組、腹膜轉(zhuǎn)移組的蛋白表

20、達量均高于不伴有腹膜轉(zhuǎn)移的原發(fā)組(both P＜0.001)。
　　 2.3 根據(jù)CTHRC1表達的平均值0.224，我們將所有納入課題的患者分為CTHRC1高表達組和低表達組。高表達組患者的生存時間為31.36±5.63個月，而低表達組的生存時間為57.84±3.69個月，兩組的生存時間差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。
　　 2.4 Cox回歸分析顯示同性別、腫瘤浸潤深度、腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移一樣，CTHRC1的

21、表達水平也是一個影響患者生存獨立因素，而且CTHRC1高表達組死亡的風險是低表達組的2.754倍(P＜0.001，95％CI1.731 to4.383)。
　　 （三）基因CTHRC1與hsa-mir-520d關(guān)系的初步探討
　　 1.CTHRC1與hsa-mir-520d靶向關(guān)系的初步預(yù)測。
　　 1.1 以CTHRC1為檢索詞在miRDB、miRanda、miRWalk、TargetScan四個預(yù)測網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)共

22、同交集hsa-mir-520d。并預(yù)測出hsa-mir-520d與CTHRC13'UTR區(qū)有結(jié)合位點。
　　 1.2 RT-PCR法檢測Mir-520D-5P在四種不同結(jié)直腸癌細胞株中的表達。其中SW480細胞的表達量最高178.493±7.867，SW620為7.09±2.73，P＜0.001，與CTHRC1蛋白表達水平呈負相關(guān)關(guān)系。
　　 2.CTHRC1與mir-520D-5P相關(guān)性分析
　　 2.1 RT

23、-PCR法檢測23對結(jié)直腸癌配對組織中mir-520d-5P表達情況。結(jié)果顯示癌旁、正常組織中mir-520D-5P的表達量明顯高于配對癌組織中mir-520d-5P的表達，且差異存在顯著性(P=0.001)
　　 2.2 Western blot檢測23對結(jié)直腸癌配對組織中CTHRC1蛋白水平表達情況Western blot檢測23對結(jié)直腸癌組織中CTHRC1的蛋白表達水平，用Geopro32軟件對Western blot結(jié)果

24、圖片進行分析，用灰度值代表蛋白表達的數(shù)值，GAPDH為內(nèi)參照。用CTHRC1的灰度值比GAPDH的灰度值代表蛋白表達的強弱，用配對樣本t檢驗檢測可知，癌組織中CTHRC1的表達量明顯高于配對的正常組織中CTHRC1的表達，數(shù)值分別是1.3018±1.016，0.6567±0.552且差異存在具有統(tǒng)計學意義(P=0.003)。由以上結(jié)果可推測在組織水平上CTHRC1與mir-520D-5P是負相關(guān)的關(guān)系。
　　 2.3 miR-5

25、20d-5p對結(jié)直腸癌細胞中CTHRC1蛋白表達水平變化的影響2.3.1結(jié)直腸癌細胞SW480瞬時轉(zhuǎn)染mimics和inhibitor后，miR-520D-5P在細胞水平上的變化miRNA mimics是模擬生物體內(nèi)源的miRNAs，運用化學合成的方法合成，能增強內(nèi)源性miRNA的功能。而miRNA inhibitor是化學修飾的專門針對細胞中特異的靶miRNA的抑制劑。SW480細胞瞬時轉(zhuǎn)染mimics和inhibitor24h后檢測

26、發(fā)現(xiàn)，mimics組miR-520D-5P的表達量為161.167±16.06而對應(yīng)的NC組為19.456±3.53，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。而inhibitor組比對應(yīng)NC組正相反，NC組miR-520D-5P的表達量要高于inhibitor組，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.002)2.3.2結(jié)直腸癌細胞瞬時轉(zhuǎn)染后CTHRC1蛋白水平表達變化轉(zhuǎn)染SW480細胞48h以后檢測CTHRC1蛋白表達變化發(fā)現(xiàn)，miR-520D

27、-5Pmimics發(fā)揮了模擬生物體內(nèi)源性miRNA的作用，使CTHRC1蛋白表達下調(diào)，而inhibitor則發(fā)揮了沉默miR-520d-5p的作用，使CTHRC1蛋白表達上升。
　　 結(jié)論：
　　 1.基因CTHRC1是結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。
　　 2.基因CTHRC1的高表達與腹膜轉(zhuǎn)移有關(guān)而且預(yù)示患者預(yù)后不佳。
　　 3.基因CTHRC1能抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖卻又可以促進癌細胞的遷移。