Ras相關(guān)核蛋白R(shí)an促進(jìn)結(jié)直腸癌惡性表型的機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。由于早期結(jié)直腸癌患者缺乏典型癥狀，多數(shù)患者就診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。晚期結(jié)直腸癌患者治療效果不佳，五年生存率只有10％。因此對(duì)于中晚期結(jié)直腸癌患者，亟需一種或多種腫瘤標(biāo)志物來(lái)判斷腫瘤的預(yù)后或預(yù)測(cè)腫瘤的治療療效以指導(dǎo)患者用藥，以期真正達(dá)到腫瘤的個(gè)體化治療。Ras相關(guān)核蛋白R(shí)an是我們前期通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，能夠和Txl-2b相互作用的蛋白質(zhì)。Ran在正常細(xì)胞的物質(zhì)核漿轉(zhuǎn)運(yùn)和有絲分裂中發(fā)揮著重要作

2、用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Ran在大多數(shù)腫瘤中高表達(dá)，并且可以促進(jìn)腫瘤的一些惡性表型的發(fā)生，例如促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥等，但是其促瘤機(jī)制目前尚不完全清楚。
　　目的：
　　1.檢測(cè)Ran在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)。
　　2.構(gòu)建Ran的下調(diào)及過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型。
　　3.觀察Ran對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖凋亡能力的影響。
　　4.觀察Ran對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。<

3、br>　　5.探討Ran促進(jìn)結(jié)直腸癌惡性表型發(fā)生的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.檢測(cè)Ran在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)
　　1)IHC檢測(cè)Ran在結(jié)直腸癌組織芯片中原發(fā)灶、癌旁組織及轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)，分析Ran在正常組織、原位癌組織和轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)強(qiáng)度的差異。
　　2)Western blot及實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)正常腸上皮細(xì)胞及多種結(jié)腸癌細(xì)胞株Ran的蛋白及RNA水平，并篩選出適合構(gòu)建細(xì)胞模型的細(xì)胞株。

4、　　2.構(gòu)建Ran的下調(diào)及過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型
　　1)細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Ran-siRNA Oligos并驗(yàn)證其干擾效率。
　　2)Ran-shRNA慢病毒感染HCT116及DLD-1細(xì)胞系構(gòu)建Ran下調(diào)細(xì)胞模型并驗(yàn)證其干擾效率。
　　3)Ran-sgRNA慢病毒感染HT29及SW480細(xì)胞系構(gòu)建Ran過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型并驗(yàn)證其過(guò)表達(dá)效率。
　　3.Ran對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖凋亡能力的影響
　　1)CCK8法在Ran的干擾和

5、過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型中檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖能力。
　　2)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)Ran-siRNA Oligos轉(zhuǎn)染后腫瘤細(xì)胞的凋亡。
　　3)Western blot檢測(cè)Ran-siRNA Oligos轉(zhuǎn)染后caspase-3和PARP的改變。
　　4.Ran對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　1)Transwell實(shí)驗(yàn)在體外檢測(cè) Ran的干擾和過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型中結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　2)裸鼠尾靜脈注射腫瘤細(xì)胞

6、配合小動(dòng)物活體成像技術(shù)檢測(cè)Ran下調(diào)細(xì)胞模型的體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力。
　　5.Ran促進(jìn)結(jié)腸癌惡性表型發(fā)生的分子機(jī)制
　　1)Western blot檢測(cè)Ran干擾和過(guò)表達(dá)的細(xì)胞模型核漿蛋白中p53、β-catenin、NF-κB、EGFR以及總蛋白中EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、ERK、p-ERK的表達(dá)。
　　2)實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)Ran過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型中EGFR的表達(dá)。
　　3)免疫熒光檢測(cè)Ran下調(diào)

7、后DLD-1細(xì)胞中Ran和p-EGFR的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.在45例結(jié)直腸癌原發(fā)灶組織、34例癌旁組織、51例轉(zhuǎn)移灶組織中，Ran在結(jié)直腸癌原發(fā)灶中的表達(dá)明顯高于癌旁組織（P=0.02），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而Ran在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)明顯高于原發(fā)灶（P=0.0008），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；實(shí)時(shí)定量熒光PCR和Western blot分別檢測(cè)Ran在結(jié)直腸癌細(xì)胞中mRNA和總蛋白水平的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：無(wú)論是在

8、mRNA水平或總蛋白水平，Ran在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正常腸上皮細(xì)胞HIEC。
　　2.siRNA轉(zhuǎn)染HCT116和DLD-1細(xì)胞系，實(shí)驗(yàn)組Ran蛋白水平表達(dá)量均明顯低于陰性對(duì)照組。HCT116細(xì)胞中，si-1和si-2在20nM時(shí)抑制效果最好，抑制效率均大于70%。DLD-1細(xì)胞中，雖然抑制效率不如HCT116，但同樣是si-1和si-2在20nM時(shí)抑制效果最好，抑制效率均大于50%。故選擇si-1干擾序列包裝慢病毒進(jìn)行后

9、續(xù)實(shí)驗(yàn)，且將體系中siRNA終濃度優(yōu)化為20nM；實(shí)時(shí)定量熒光PCR和Western blot結(jié)果顯示：在HCT116和DLD-1中，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Ran的mRNA水平分別下調(diào)了71%和59%。并且與對(duì)照組相比，Ran在蛋白水平也有較為明顯的下調(diào)。Ran的下調(diào)細(xì)胞模型構(gòu)建成功。而在SW480和HT29中，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Ran在mRNA水平分別上調(diào)了3.5倍和3.7倍。并且與對(duì)照組相比，Ran在蛋白水平也有明顯的上調(diào)。故Ran

10、的過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型構(gòu)建成功。
　　3.在HCT116和DLD-1的Ran下調(diào)細(xì)胞模型中，與對(duì)照組相比，從第3天開(kāi)始，HCT116實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)速度顯著降低；從第2天開(kāi)始，DLD-1實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)速度顯著降低，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在SW480和HT29的Ran過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型中，與對(duì)照組相比，兩種細(xì)胞均從第5天開(kāi)始，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)速度顯著加快，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.HCT116和DLD-1細(xì)胞si-1組早期凋亡率較NC組增

11、加，晚期凋亡率si-1組、si-2組晚期凋亡率較NC組顯著增加；si-1組和si-2組與NC組相比，caspase-3表達(dá)無(wú)顯著變化，cleaved caspase-3表達(dá)水平顯著升高。PARP表達(dá)有所下降，cleaved PARP表達(dá)顯著升高。
　　5.體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在Ran的下調(diào)細(xì)胞模型中，與對(duì)照組相比，HCT116和DLD-1細(xì)胞的遷移和侵襲能力均明顯減低。在Ran的過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型中，與對(duì)照組相比，SW480和HT29細(xì)

12、胞的遷移和侵襲能力均明顯增強(qiáng)；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，穩(wěn)定下調(diào)Ran的HCT116細(xì)胞在裸鼠肺臟形成轉(zhuǎn)移灶的能力明顯低于對(duì)照組，鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組肺臟轉(zhuǎn)移灶的大小明顯大于對(duì)照組。
　　6.Western blot檢測(cè)核漿蛋白結(jié)果顯示：EGFR、β-catenin、NF-κB在細(xì)胞核中表達(dá)明顯減少；而p53在細(xì)胞核中表達(dá)明顯增多；在Ran的干擾細(xì)胞模型HCT116-shRan中，與對(duì)照組相比，p-EGFR、Akt、p-Akt、ERK、p-ER

13、K的表達(dá)均明顯減少。在Ran的過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型SW480-Ran和HT29-Ran中，與對(duì)照組相比，EGFR、p-EGFR、p-Akt、ERK、p-ERK的表達(dá)均明顯增多。實(shí)時(shí)定量熒光PCR結(jié)果顯示：在Ran的過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型中，與對(duì)照組相比，SW480-Ran的EGFR mRNA水平上調(diào)到原來(lái)的1.8倍，HT29-Ran的EGFR mRNA水平上調(diào)到原來(lái)的1.9倍。免疫熒光結(jié)果顯示：在DLD-1細(xì)胞中利用siRNA下調(diào)Ran的表達(dá)后，Ra

14、n的熒光強(qiáng)度下調(diào)72%，p-EGFR熒光強(qiáng)度下調(diào)35%。
　　結(jié)論：
　　1.Ran在結(jié)直腸癌癌旁組織、原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)依次增高，且Ran在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中高表達(dá)。
　　2.Ran可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，并且抑制caspase-3介導(dǎo)的凋亡作用。
　　3.Ran可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移。
　　4.Ran可能通過(guò)調(diào)控EGFR的表達(dá)并影響Ras/MAPK/ERK和PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤的惡