NF-κB信號(hào)通路對(duì)肺腺癌細(xì)胞株H1299高氧化應(yīng)激條件下hTERT線粒體轉(zhuǎn)位的影響.pdf

1、研究背景與目的：
　　肺癌仍是最普遍和最致命的的癌癥,其發(fā)病率與病死率在過(guò)去的幾十年內(nèi)迅速增長(zhǎng),迄今為止,病死率已居惡性腫瘤之首。目前對(duì)于肺癌的治療手段主要有：手術(shù)治療、化療、放療、靶向治療等，已經(jīng)形成了多學(xué)科綜合治療方案。但是肺癌患者的5年生存率仍然較低。因此研究者們?cè)诜e極的探索肺癌新的治療方法。
　　端粒酶是由RNA組分和蛋白組分組成的核蛋白體。其中人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse tr

2、anscriptase, hTERT）是端粒酶的催化亞基是端粒酶活性的必需和限速成分,其水平?jīng)Q定細(xì)胞端粒酶的活性。端粒酶活性被認(rèn)為在細(xì)胞永生化和癌變中起關(guān)鍵作用，與肺癌的發(fā)生，發(fā)展，轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，因此hTERT有望成為肺癌治療的新靶點(diǎn)。
　　hTERT主要功能是維持端粒的長(zhǎng)度，而近年來(lái)hTERT許多非依賴端粒的作用被發(fā)現(xiàn)，包括：基因的表達(dá)調(diào)控，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的調(diào)控，在線粒體中保護(hù)線粒體的功能等。同時(shí)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)了hTERT在

3、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分布情況：約60％在細(xì)胞核、20%在線粒體、20%在細(xì)胞質(zhì)。然而這個(gè)比例并不是一成不變的，在高氧化應(yīng)激條件下，核內(nèi)的hTERT于24小時(shí)內(nèi)向核外轉(zhuǎn)移50%-60%。因此，hTERT在細(xì)胞內(nèi)處于動(dòng)態(tài)的平衡，在線粒體hTERT保護(hù)線粒體DNA(mtDNA)降低線粒體活性氧（reactive oxygen species，ROS）進(jìn)而維持細(xì)胞的活性是細(xì)胞受到刺激后自我修復(fù)的重要機(jī)制之一。
　　核轉(zhuǎn)錄因子kappaB（Nucl

4、ear factor kappa B NF-κB）是一種重要的轉(zhuǎn)錄激活因子。其主要參與機(jī)體防御反應(yīng)，應(yīng)激，細(xì)胞分化和凋亡等過(guò)程的信息傳遞。研究表明：NF-κB信號(hào)通路與hTERT的表達(dá)密切相關(guān)。NF-κB信號(hào)通路激活可以通過(guò)核轉(zhuǎn)位結(jié)合hTERT啟動(dòng)子調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平hTERT含量。在我們課題組前期的實(shí)驗(yàn)中表明NF-κB抑制后可有效減少hTERT在肺癌中的表達(dá)，并對(duì)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。那么NF-κB信號(hào)通路是否對(duì)細(xì)胞高ROS下hTERT線

5、粒體轉(zhuǎn)位有影響呢？這成為我們研究的重點(diǎn)。
　　本課題中用抗氧化劑二硫代氨基甲酸吡咯烷（Ammonium pyrrolidinedithiocarbamate PDTC）來(lái)抑制NF-κB信號(hào)通路。研究NF-κB信號(hào)通路對(duì)肺癌細(xì)胞株H1299高氧化應(yīng)激條件下hTERT線粒體轉(zhuǎn)位中的作用。完善hTERT核-線粒體轉(zhuǎn)位并保護(hù)線粒體功能完整的機(jī)制。
　　研究?jī)?nèi)容和方法：
　　1．Real Time RT-PCR、Western

6、Blot技術(shù)檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路活性抑制時(shí)高氧化應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)細(xì)胞hTERTmRNA和蛋白的表達(dá)情況
　　2．免疫熒光、Western Blot技術(shù)檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路活性抑制時(shí)高氧化應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)細(xì)胞hTERT核-線粒體轉(zhuǎn)位的影響
　　3．Real Time RT-PCR、Western Blot技術(shù)檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路主要蛋白P65與hTERT轉(zhuǎn)位之間的關(guān)系
　　結(jié)果：
　　1. Real Time RT-

7、PCR、Western Blot技術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明：在高氧化應(yīng)激狀態(tài)下hTERTmRNA和蛋白的表達(dá)量明顯增加，而抑制 NF-κB信號(hào)通路活性后hTERTmRNA和蛋白的表達(dá)量沒有明顯增加；
　　2. 線粒體蛋白Western Blot結(jié)果提示：在高氧化應(yīng)激狀態(tài)下hTERT向線粒體轉(zhuǎn)位，抑制NF-κB信號(hào)通路活性后高氧化應(yīng)激狀態(tài)下hTERT線粒體轉(zhuǎn)位減少；
　　3. 免疫熒光結(jié)果提示：在高氧化應(yīng)激狀態(tài)下 hTERT向線粒體轉(zhuǎn)位

8、，抑制NF-κB信號(hào)通路活性后hTERT線粒體轉(zhuǎn)位減少；
　　4．Real Time RT-PCR、Western Blot技術(shù)檢測(cè)結(jié)果提示：在高氧化應(yīng)激條件下hTERT向線粒體轉(zhuǎn)位NF-κB P65 mRNA、蛋白表達(dá)增加。
　　結(jié)論：
　　1. NF-κB信號(hào)通路活性的抑制能夠下調(diào)高氧化應(yīng)激引起的hTERT高表達(dá)；
　　2. NF-κB信號(hào)通路活性的抑制可以減少hTERT的線粒體轉(zhuǎn)位；
　　3. NF-