李斯特菌侵染Vero細胞誘發(fā)磷脂酶D活性變化的初步研究.pdf

1、目的：以產(chǎn)單核細胞李斯特菌(簡稱李斯特菌)感染Vero細胞，建立細菌侵入非吞噬細胞的模型，對李斯特菌刺激下的Vero細胞內(nèi)PLD活性變化及其對李斯特菌侵染量的影響進行初步研究。 方法： 1、將李斯特菌以不同感染比(細菌：細胞)及不同感染時間刺激Vero細胞，觀察Vero細胞內(nèi)PLD活性及李斯特菌侵染量的變化。李斯特菌的侵染量用Vero細胞內(nèi)釋放的活菌數(shù)表示。PLD的活性用在乙醇存在條件下，其催化產(chǎn)生的特異性產(chǎn)物磷脂酰乙醇

2、在<'[9，10-<'3>H]>油酸標記的磷脂類化合物總量中的百分比表示。 2、分別以PLD的不同化學抑制劑(1-丁醇及2,3-二磷酸甘油酸)預處理Vero細胞，再以李斯特菌刺激，觀察Vero細胞內(nèi)PLD活性變化對李斯特菌侵染量的影響。 3、分別用人PLDl野生型(hPLD1wt)及功能缺陷型(hPLD1-K898R)、鼠PLD2野生型(mPLD2wt)及功能缺陷型(mPLD2-K758R)的重組腺病毒預感染Vero細胞

3、，以空白腺病毒作對照，再以李斯特菌刺激，觀察不同亞型PLD蛋白在Vero細胞內(nèi)的過量表達對李斯特菌誘導的胞內(nèi)PLD活性變化及李斯特菌侵染量的影響，以確定可能參與調(diào)控李斯特菌侵染Vero細胞的PLD亞型。 結(jié)果： 1、在一定范圍內(nèi)，李斯特菌的侵染量隨著感染比的增加(100:1、200:1、400:1)和感染時間的延長(30min、60min、120min)而升高。并且在李斯特菌內(nèi)化侵入Vero細胞的過程中確實伴有PLD的激

4、活，與Vero細胞內(nèi)PLD的基礎活性相比，李斯特菌的刺激可導致Vero細胞內(nèi)PLD活性升高4倍左右。李斯特菌刺激不同時間后(15min到90min)Vero細胞內(nèi)的PLD活性呈現(xiàn)動態(tài)變化：與基礎活性相比，李斯特菌刺激15min后，PLD即顯示較高活性；隨著刺激時間的延長，PLD的活性也隨之增高，但在40min到90min之間趨于穩(wěn)定。 2、1-丁醇的預處理可導致李斯特菌刺激下的Vero細胞內(nèi)PLD活性顯著降低(約60％左右)，并

5、且李斯特菌的侵染量也明顯下降(約68％左右)；2,3-二磷酸甘油酸的預處理同樣可導致李斯特菌刺激下Vero細胞內(nèi)PLD活性的降低和李斯特菌侵染量的下降。 3、4株P(guān)LD重組腺病毒可有效感染Vero細胞，并對Vero細胞內(nèi)PLD的基礎活性影響不大。hPLD1wt蛋白的過量表達使李斯特菌刺激下的Vero細胞內(nèi)PLD活性上升50％左右；而hPLD1-K898R和mPL2-K758R蛋白的過量表達使李斯特菌刺激下的Vero細胞內(nèi)PLD活