利用不同方法對大鼠胚胎干細胞轉染紅色熒光蛋白表達載體的研究.pdf

1、2008年Mia Buehr和Ping Li等成功建立了大鼠胚胎干細胞(Rat embryonicstem cells，rESCs)系，為干細胞研究領域提供了一個全新的研究模型。大鼠因其獨特的物種屬性及其在心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等特殊疾病的研究領域的獨特優(yōu)勢，一直以來被廣泛應用于生物學和醫(yī)學等自然科學研究領域。而rESCs的出現(xiàn)為建立基因修飾的大鼠動物模型提供了更優(yōu)質(zhì)的實驗材料，對大鼠轉基因研究方法的改進起到關鍵作用。然而，對rESCs進

2、行有效的遺傳操作是生產(chǎn)基因修飾的大鼠動物模型的基礎。本實驗通過將紅色熒光蛋白表達載體導入rESCs，尋找最優(yōu)的rESCs轉基因方法，為建立基因修飾的大鼠動物模型提供新的思路和方法，從而為rESCs在干細胞研究和異種移植等領域的應用奠定基礎。
　　目的：以大鼠胚胎干細胞(rESCs)為研究對象，通過比較利用脂質(zhì)體轉染、電穿孔轉染及核轉染等轉染技術將表達紅色熒光蛋白（red fluorescenceprotein，RFP）的pEF1a

3、lpha-DsRed-Express2 Vector質(zhì)粒載體導入rESCs，并比較不同轉染技術的轉基因效率，以期尋找更好的rESCs轉基因方法，并探討轉基因過程對rESCs干細胞特性是否產(chǎn)生影響。
　　方法：利用脂質(zhì)體法、電穿孔法和核轉染法等轉染方法將表達紅色熒光蛋白(RFP)的pEF1 alpha-DsRed-Expres s2 Vector質(zhì)粒載體導入rESCs中，轉染后即運用臺盼藍進行染色，統(tǒng)計轉染后rESCs的細胞存活率;

4、并于48h后觀察rESCs內(nèi)紅熒光蛋白表達情況，從而比較不同轉染技術之間的轉染效率差異，確定效率最佳的轉染技術和轉染條件。然后，運用堿性磷酸酶染色(AP)、反轉錄PCR(RT-PCR)和免疫熒光染色等方法對轉染前后的rESCs進行干細胞特性方面的檢測，探討轉基因過程對rESCs干細胞特性的影響。
　　結果：在本實驗采取的幾種轉染方法中，核轉染技術能獲得較高的轉染效率;且在核轉染條件為A13時，可獲得最高的rESCs紅熒光蛋白轉染效