用雙歧桿菌構(gòu)建產(chǎn)腸毒素大腸桿菌LTB口服活疫苗及其粘膜免疫佐劑功能研究.pdf

1、在世界范圍內(nèi)，產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)感染是引起腹瀉最重要的因素之一。它是發(fā)展中國家腹瀉發(fā)病和嬰兒死亡的主要原因，也是旅行者腹瀉與國家士兵腹瀉的最常見病原菌。因此，一個(gè)安全有效的抵抗ETEC腹瀉的疫苗對(duì)公眾健康是非常重要的。 ETEC是非侵襲性的，是依靠定居因子(CFA)粘附小腸粘膜上的，進(jìn)而分泌腸毒素LT和ST。CFAs是細(xì)菌細(xì)胞表面的鞭毛，可以促進(jìn)對(duì)小腸上皮細(xì)胞的粘附，主要有CFA/Ⅰ、CFA/Ⅱ和CFA/Ⅳ家族菌毛抗原

2、。最普遍的CFAs是CFA/Ⅰ。ST是由estA基因編碼的19個(gè)氨基酸組成的單體多肽，免疫原性很差。LT是由eltAB編碼，結(jié)構(gòu)與霍亂毒素(CT)相似。它由兩個(gè)亞單位組成即有毒性的A單位(LTA)和五聚體的B單位(LTB)組成。CT和LT有很強(qiáng)的免疫原性和粘膜佐劑活性。LTB也和CTB一樣有很強(qiáng)的免疫原性和佐劑活性。本研究中選用LTB作為免疫原和粘膜免疫佐劑。 ETEC疫苗要求能夠中和大多數(shù)ETEC菌株的毒力因子抗原，目前普遍認(rèn)

3、為一個(gè)合理的大腸桿菌疫苗應(yīng)該包括三個(gè)主要的菌毛抗原即CFA/Ⅰ,CFA/Ⅱ,和CFA/Ⅳ以及具有免疫原性的不耐熱腸毒素LT。因此在研究LTB免疫活性時(shí)選用CFA/I為參照。目前ETEC疫苗研究熱點(diǎn)集中在三個(gè)方向：1.免疫方式由傳統(tǒng)的肌肉、皮下等轉(zhuǎn)為粘膜免疫；2。免疫途徑上尋求粘膜佐劑，常用CT和LT；3.表達(dá)載體由傳統(tǒng)的有毒轉(zhuǎn)向減毒或無毒載體。根據(jù)以上三點(diǎn)，我們采用無毒的雙歧桿菌為表達(dá)載體，通過粘膜免疫SD大鼠，檢LTB的免疫原性，并與

4、重組的雙歧桿菌-CFA/I疫苗共免疫以檢測其粘膜佐劑活性。雙歧桿菌是人類腸道的自然宿主且可以粘附于腸道上皮細(xì)胞。 因此，本研究的目的是將雙歧桿菌發(fā)展成一個(gè)表達(dá)LTB蛋白的口服活疫苗的抗原表達(dá)系統(tǒng)。 目的：構(gòu)建攜帶ETEC LTB的雙歧桿菌重組疫苗，然后將此載體疫苗免疫SD大鼠，檢測其在大鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的體液和粘膜免疫應(yīng)答，并與雙歧桿菌重組的pBES-CFA/I疫苗共免疫，檢測其粘膜免疫佐劑的效應(yīng)。 方法：(1)以pB

5、V220為基礎(chǔ)，構(gòu)建穿梭表達(dá)載體pBES-LTB。將其電轉(zhuǎn)化嬰兒雙歧桿菌，SDS-PAGE驗(yàn)證蛋白的表達(dá)，并通過家兔腸袢實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表達(dá)蛋白的安全性。(2)用雙歧桿菌重組載體疫苗免疫SD大鼠：隨機(jī)分四組分別為PBS、pBES-LTB、pBES-CFA/I和pBES-LTB+PBES-CFAB組，每組12只，免疫三次(0，10，17天)，并于0，7，10，14，17，22和27天采血和糞便樣本，ELISA檢測其特異抗體水平。(3)在第27天，

6、每組一半大鼠腹腔感染致死劑量ETEC毒株H10407，連續(xù)觀察20天，計(jì)算其存活力。另一半鼻飼ETEC H1 0407，觀察其肺部感染情況。 結(jié)果： (1)LTB蛋白在雙歧桿菌中成功表達(dá)，其表達(dá)蛋白經(jīng)家兔腸袢實(shí)驗(yàn)證實(shí)是微毒的。 (2)ELISA結(jié)果表明：pBES-LTB與pBES-CFA/I疫苗聯(lián)合免疫組的大鼠比其它單獨(dú)免疫組產(chǎn)生了更強(qiáng)烈的血清IgG和糞便IgA抗體(P＜0.05)。LTB免疫組和CFA/I免疫組間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意

7、義(P＞0.05)。(3)腹腔攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，pBES-LTB+pBES-CFA/I免疫組的SD大鼠保護(hù)性比單獨(dú)免疫組的好，單獨(dú)口服天然雙歧桿菌和PBS的免疫組無保護(hù)性。 (4)ETEC鼻飼實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：pBES-LTB+pBES-CFA/I免疫組及pBES-CFA/I單獨(dú)免疫的SD大鼠肺部均無病理變化，pBES-LTB免疫組有一定的炎癥反應(yīng)，未免疫組肺部有嚴(yán)重的病理變化。 結(jié)論：(1)雙歧桿菌可以作為ETEC重組口服活疫