K88ac+產(chǎn)腸毒素大腸桿菌sRNA伴侶蛋白Hfq毒力相關(guān)功能的研究.pdf

1、豬源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是指主要引起新生幼畜腹瀉最常見的病原性大腸桿菌，其引起宿主致病的主要毒力因子包括黏附素，腸毒素，溶血素，鞭毛等。由其引起的斷奶仔豬腹瀉(Porcine post-weaning diarrhea，PWD)是導(dǎo)致仔豬發(fā)病死亡的重要原因，也是造成全球養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的重要因素之一。細(xì)菌非編碼sRNA是一類新型的基因調(diào)控子，主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因

2、的表達(dá)。鑒于sRNA伴侶蛋白Hfq在調(diào)控多種細(xì)菌表型、生長(zhǎng)代謝、生物被膜形成及致病性等方面均發(fā)揮十分重要的作用，但其在豬源ETEC中的靶標(biāo)基因及調(diào)控作用還不清楚，本研究針對(duì)ETEC C83902中伴侶蛋白Hfq的毒力相關(guān)調(diào)控作用進(jìn)行了如下研究。
　　1.K88ac+產(chǎn)腸毒素大腸桿菌sRNA伴侶蛋白Hfq毒力相關(guān)調(diào)控功能研究
　　本研究通過λ-Red同源重組技術(shù)構(gòu)建hfq基因缺失株C83902Δ hfq，并通過基因克隆技術(shù)構(gòu)建

3、其回補(bǔ)株C83902Δ hfq/phfq。在轉(zhuǎn)錄水平上，以大腸桿菌gapA基因?yàn)閮?nèi)參，通過qRT-PCR檢測(cè)fimA基因（編碼Ⅰ型菌毛主要結(jié)構(gòu)亞基）、fliC基因（編碼鞭毛主要亞單位）、faeG基因（編碼K88菌毛主要結(jié)構(gòu)亞基）、eltB基因（編碼LT毒素B亞單位）、ecpA基因（編碼共生菌毛主要亞單位）、luxS基因和pfs基因（編碼群體感應(yīng)相關(guān)因子）的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比野生株C83902，hfq基因缺失株C83902Δ hfq中f

4、imA、faeG、ecpA基因表達(dá)量均顯著下調(diào)，分別下調(diào)了63.1％(P＜0.01)、38.8％(P＜0.01)、39.4％(P＜0.01); fliC、eltB、luxS、pfs基因表達(dá)量均少許上調(diào)，但差異不顯著(P＞0.05)。在蛋白表達(dá)水平上，以GapA蛋白為內(nèi)參，通過Western blot檢測(cè)三種菌株中FimA、FaeG、EcpA、FliC四種蛋白表達(dá)量的變化，三次平行試驗(yàn)后，對(duì)Western blot試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行灰度值量化分

5、析，結(jié)果顯示，hfq基因缺失株中FimA、FaeG、EcpA三種蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)，相比野生株，分別下調(diào)了29％（P＜0.05）、23.8％(P＜0.05)、20％（P＜0.05），但FliC蛋白表達(dá)量變化不明顯，此結(jié)果與qRT-PCR試驗(yàn)結(jié)果相一致。綜合上述結(jié)果，我們推測(cè)伴侶蛋白Hfq能調(diào)控ETECC83902中ecpA、 faeG、fimA菌毛基因及相關(guān)蛋白的表達(dá)，但是否影響其致病性有待后續(xù)驗(yàn)證。
　　2.K88ac+產(chǎn)腸毒素

6、大腸桿菌sRNA伴侶蛋白Hfq對(duì)其致病性調(diào)控作用研究
　　在上述研究一結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過生長(zhǎng)試驗(yàn)、生物被膜定性及定量試驗(yàn)、IPEC-J2細(xì)胞黏附試驗(yàn)和小鼠攻毒試驗(yàn)，探究伴侶蛋白Hfq對(duì)ETEC致病性的影響。結(jié)果表明，缺失株C83902Δhfq在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)速率明顯低于野生株（P＜0.05）;生物被膜的形成能力及對(duì)IPEC-J2細(xì)胞黏附能力均顯著下調(diào)，相比野生株分別下調(diào)了80％（P＜0.01）和78％（P＜0.01），而回補(bǔ)株的生

7、長(zhǎng)、生物被膜形成及細(xì)胞黏附性均有部分恢復(fù)。隨后，以SPF級(jí)BALB/c小鼠為模型設(shè)計(jì)小鼠攻毒試驗(yàn)，采用直接灌胃方法分別對(duì)各攻毒組小鼠接種109cfu劑量的三株菌懸液，定期觀察接種后小鼠狀態(tài)（飲水、飲食、精神狀況和死亡情況），72h后，采集腸液稀釋涂板計(jì)數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生株C83902組及回補(bǔ)株組小鼠均出現(xiàn)采食量減少，行動(dòng)遲緩，解剖時(shí)腸道有輕微鼓氣和充血，缺失株C83902Δhfq組和PBS組小鼠則無上述癥狀;平板計(jì)數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生株相