產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌K-,99-菌毛蛋白的表達(dá)與免疫研究.pdf

1、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEc)是引起幼畜腹瀉的主要病原之一，該菌的致病性與其具有黏附素和產(chǎn)腸毒素密切相關(guān)。迄今，在幼畜的ETEC中發(fā)現(xiàn)的黏附素抗原有K<,88>、K<,99>、987P、F<,41>、F<,42>、。F<,165>、F<,17>、F<,18>等，而以K<,88>、K<,99>、987P、F<,41>最為流行。黏附素是一種具有良好免疫原性的蛋白質(zhì)抗原，用帶有

2、黏附素的菌體或純化的黏附素抗原免疫動物均可以產(chǎn)生高效價的相應(yīng)抗體。 本研究應(yīng)用PCR方法從產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(ETEC)中擴(kuò)增出不含信號肽序列的K<,99>菌毛蛋白基因(476bp)，將此基因片段克隆到原核表達(dá)載體pET-32a上，經(jīng)過酶切、PCR及DNA序列分析，篩選出重組質(zhì)粒DNApET-32a-K<,99>，并在大腸桿菌BL21中獲得高效表達(dá)。鑒定表達(dá)的重組K<,99>融合蛋白(34kDa)經(jīng)鎳柱分離純化，獲得了高純度的純

3、化蛋白質(zhì)，用純化的蛋白質(zhì)免疫SPF新西蘭大白兔，獲得的抗血清可以標(biāo)準(zhǔn)的強(qiáng)毒株C<,83912>和免疫原發(fā)生特異性的抗原抗體反應(yīng)，證明了重組蛋白質(zhì)具有良好的免疫原性。 為了證明原核表達(dá)的K<,99>菌毛作為抗原的免疫保護(hù)性，此后，我們將K<,99>重組蛋白制成亞單位疫苗對動物的保護(hù)性作了初步的研究，以皮下多點注射免疫SPF級昆明系雄性/雌性小鼠，免疫后小鼠產(chǎn)生了特異性K<,99>菌毛蛋白的抗體，并在三免后達(dá)到較高水平。用致死劑量的