大腸桿菌耐熱性腸毒素STI突變體構(gòu)建及毒性的研究.pdf

1、ETEC是一類導(dǎo)致人和幼畜腹瀉(初生仔豬、犢牛、羔羊和斷奶仔豬)的病原性大腸桿菌，主要有兩類致病因子：一類為腸毒素，另一類為黏附素(或稱定居因子)。菌體產(chǎn)生的多種外毒素在大腸桿菌致病性中扮演了重要角色，其中耐熱性腸毒素即為其產(chǎn)生的主要外毒素。
　　 本研究首先利用PCR技術(shù)，從產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌強(qiáng)毒株C83922中克隆出STI基因，進(jìn)一步通過(guò)PCR和寡核苷酸定點(diǎn)突變技術(shù)，將耐熱性腸毒素STI毒素中心的3個(gè)Cys分別突變成Ser和

2、Gly，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，獲得了該突變基因的重組菌株。在此基礎(chǔ)上，對(duì)重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了Tricine-SDS-PAGE和Western blotting分析；并對(duì)蛋白的毒性進(jìn)行了研究。從而為進(jìn)一步研制預(yù)防產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌引起的犢牛、羔羊壞死性腸炎等疾病提供理想的基因工程候選菌株。研究結(jié)果如下：
　　 1.利用PCR技術(shù)，從產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌強(qiáng)毒株C83922中克隆出STI毒素基因，并進(jìn)行了核苷酸序列

3、測(cè)定。結(jié)果表明，核苷酸序列與國(guó)外報(bào)道的序列一致。
　　 2.通過(guò)PCR和寡核苷酸定點(diǎn)突變技術(shù)，將耐熱性腸毒素STI毒素中心的3個(gè)Cys分別突變成Ser和Gly，并且成功獲得了大腸桿菌耐熱性腸毒素STI的6種突變體(Cys→Gly)：STIC10/G、STIC14/G、STIC17/G，突變體(Cys→Ser)：STIC10/S、STIC14/S、STIC17/S。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步成功構(gòu)建了含有6種STI突變體的分泌型表達(dá)載體p

4、ESG10、pESG14、pESG17、pESS10、pESS14、pESS17及相應(yīng)的重組菌株。
　　 3.對(duì)重組菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE和Western blotting分析，結(jié)果表明，該重組菌株可以表達(dá)耐熱性腸毒素STI突變體蛋白，蛋白含量占菌體總蛋白最高比例可達(dá)30％。并且表達(dá)的突變體蛋白能夠被抗血清特異性識(shí)別。
　　 4.對(duì)重組菌株進(jìn)行了毒性研究，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明重組菌株