抗精子抗體誘導(dǎo)成熟大鼠精子凋亡及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 1. 歸納并探索抗精子抗體陽性大鼠模型建立的方法，為抗精子抗體相關(guān)大鼠試驗(yàn)研究積累數(shù)據(jù)及經(jīng)驗(yàn)方法。
　　 2. 考察血清抗精子抗體和精液抗精子抗體對(duì)精子凋亡影響的差異，應(yīng)用Annexin V/PI染色聯(lián)合流式細(xì)胞儀分析抗精子抗體與精子凋亡的關(guān)系，為免疫性不育的病因研究積累資。
　　 3. 應(yīng)用JC-1染色聯(lián)合流式細(xì)胞儀、電鏡、western blot以及分光光度法分析凋亡精子中線粒體跨膜電位和超微結(jié)

2、構(gòu)、細(xì)胞色素c的釋放以及caspase-3活性的變化，為抗精子抗體致精子凋亡的途徑研究提供證據(jù)。
　　 方法：
　　 1. 建立抗精子抗體陽性SD大鼠動(dòng)物模型：取雄性SD大鼠40只，動(dòng)物等級(jí)SPF，體質(zhì)量200～230g，恒溫條件下飼養(yǎng)，自由進(jìn)水、進(jìn)食。將大鼠隨機(jī)分為2組：實(shí)驗(yàn)組30只、對(duì)照組10只。采用同種精子及福氏免疫佐劑對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)行免疫。對(duì)照組注射生理鹽水。每隔7日重復(fù)。建模周期為21～35天。
　　

3、2. 采用電射精技術(shù)取大鼠精液：自備電射精儀。管狀鼠籠固定大鼠，剪去背上腰部至骼部區(qū)域的毛，生理鹽水擦凈并潤濕皮膚。將3×3cm的銅片電極固定在剪毛區(qū)域，接電射精儀的輔助電極。桿狀電極輕輕插入大鼠肛門內(nèi)約至2～3cm，接電射精儀的刺激電極。接通電源。每只大鼠平均刺激3至7次就可射精。
　　 3. ELISA法檢測(cè)兩組大鼠血清、精液抗精子抗體：采集大鼠精液及眼眶血標(biāo)本后按照elisa試劑盒說明書步驟進(jìn)行。血清、精液抗精子抗體俱為陽

4、.性證明局部模型建立成功，為精液組。血清抗精子抗體陽性證明循環(huán)模型建立成功，為血清組。
　　 4. Annexin V/PI染色結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)三組大鼠精子的凋亡率。制備三組大鼠精子標(biāo)后，將精子標(biāo)本用精子孵育緩沖液制成（3～6）×106個(gè)/ml的懸液，取195ul精子懸液，加入5ul Annexin V（0.2mg/ml）染液。室溫避光孵育10min，離心（200×g， 5min），PBS重懸洗滌3次后再次重懸于190ul

5、PBS。加入PI（0.1mg/ml）染液10ul。室溫避光孵育20min后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。激發(fā)波長488nm，分別以紅色熒光和綠色熒光檢測(cè)細(xì)胞。每份精子懸液標(biāo)本獲取10000個(gè)細(xì)胞。經(jīng)CellQuest軟件分析得正常細(xì)胞、早期凋亡、晚期凋亡、死亡細(xì)胞所占的比例。
　　 5. JC-1單標(biāo)法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三組大鼠精子線粒體膜電位變化。將精液標(biāo)本用PBS洗滌2次后離心。PBS重懸并調(diào)整精子密度為1×106/ml。加入終濃度為5μ

6、g/ml的JC-1，37℃恒溫箱避光溫育10min，PBS洗滌除去游離的多余染料后，PBS重懸，即刻上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。激發(fā)波長488nm，應(yīng)用前向散射光（FSC）和側(cè)向散射光（SSC）設(shè)門后，通過熒光通道FL1（綠）和FL2（紅）檢測(cè)熒光強(qiáng)度，每份精子懸液標(biāo)本獲取10000個(gè)細(xì)胞。應(yīng)用CellQuest軟件獲取和分析數(shù)據(jù)，用發(fā)橙紅色熒光精子百分率表示MMP正常精子的比例。
　　 6. Western blot檢測(cè)三組大鼠精子內(nèi)細(xì)

7、胞色素c的釋放：精子標(biāo)本于玻璃勻漿器中冰浴勻漿，采取分級(jí)差速離心法將細(xì)胞核與線粒體逐級(jí)分離出來，收集為胞質(zhì)蛋白樣品和線粒體蛋白樣品。分別測(cè)定蛋白含量后加入上樣緩沖液，加熱變性，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，裁膠，半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜，封閉。分別加一抗或內(nèi)參抗體，孵育過夜。加相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，孵育1h，ECL檢測(cè)，拍照。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行灰度值分析。
　　 7. 分光光度法檢測(cè)caspa

8、se-3活性：收集三組大鼠精子后按試劑盒說明書步驟進(jìn)行caspase-3活性分析，酶標(biāo)儀讀數(shù)。
　　 8. 透射電鏡觀察實(shí)驗(yàn)組大鼠精子線粒體超微結(jié)構(gòu)變化。取大鼠精子標(biāo)本后，離心，固定。交電鏡室處理切片后，透射電鏡下觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)。
　　 9. 光學(xué)顯微鏡下觀察三組大鼠附睪內(nèi)組織結(jié)構(gòu)變化。取三組大鼠附睪，交病理科處理切片后，于光學(xué)顯微鏡下觀察其組織結(jié)構(gòu)。
　　 10. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法：所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析都應(yīng)用SAS

9、統(tǒng)計(jì)軟件。40只SD大鼠分為精液組、血清組、對(duì)照組，對(duì)其精子凋亡率、精子線粒體跨膜電位、cgspase-3活性值、細(xì)胞色素c蛋白灰度值分別行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分別采用卡方分析和單因素方差分析，計(jì)量資料用（x±s），組間比較用S-N-K法和LSD法。
　　 結(jié)果：
　　 1. 抗精子抗體檢測(cè)結(jié)果。按照試劑盒所定標(biāo)準(zhǔn)，抗精子抗體值高于60U/ml為陽性。實(shí)驗(yàn)組30只SD大鼠均為血清抗精子抗體陽性，抗體值為（79.8±7.1）U/m

10、l，其中12只為血清、精液抗精子抗體陽性，精液抗體值為（76.7±6.6）U/ml，血清抗體值為（81.5±7.7）U/ml，剩余18只為精液抗精子抗體陰性，血清抗精子抗體陽性，抗體值為（78.1±7.5）U/ml。對(duì)照組為陰性。
　　 2. Annexin V/PI染色結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)凋亡結(jié)果。精液組、血清組和對(duì)照組精子凋亡率分別為（35.88±6.49）％、（14.30±2.30）％和（12.38±2.56）％。其中血清

11、組與對(duì)照組凋亡率組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。精液組與對(duì)照組凋亡率組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。精液組與血清組凋亡率組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。
　　 3. JC-1單標(biāo)法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)精子線粒體跨膜電位結(jié)果。精液組發(fā)橙紅色熒光精子百分率為（40.25±9.50）％，血清組為（80.87±14.15）％，對(duì)照組為（81.56±12.78）％。其中精液組與對(duì)照組組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

12、<0.00 1）；精液組與血清組組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；血清組與對(duì)照組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　 4. Western blot檢測(cè)線粒體細(xì)胞色素c的釋放結(jié)果。胞漿細(xì)胞色素c與內(nèi)參灰度比值：精液組與血清組、精液組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；血清組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。線粒體細(xì)胞色素c與內(nèi)參灰度比值：精液組與血清組、精液組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；

13、血清組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。說明在AsAb作用下精液組精子線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素c發(fā)生了位置轉(zhuǎn)移，從線粒體釋放到了胞漿中。血清AsAb則對(duì)細(xì)胞色素c的釋放沒有影響。
　　 5. 分光光度法檢測(cè)精子內(nèi)caspase-3活性的結(jié)果：精液組與血清組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；精液組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；血清組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。說明AsAb作用于精子可導(dǎo)致精子Caspas

14、e 3活性的上升，但血清AsAb則無影響。
　　 6. 透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)結(jié)果。精液組精子線粒體大小不一，分布不均，有明顯的腫脹，部分出現(xiàn)畸形或巨型線粒體，呈空泡狀，線粒體嵴模糊甚至缺失。血清及對(duì)照組超微結(jié)構(gòu)正常。
　　 7. 光學(xué)顯微鏡下觀察三組大鼠附睪組織結(jié)構(gòu)可見精液組大鼠附睪，上皮細(xì)胞增生，間質(zhì)細(xì)胞水腫，管腔狹窄，且管腔內(nèi)精子數(shù)量明顯減少。血清及對(duì)照組正常。
　　 結(jié)論：
　　 1. 本實(shí)驗(yàn)

15、采用的同種異體精子加福氏免疫佐劑對(duì)大鼠進(jìn)行免疫的建模方法成功率高，周期短，且可建立精液抗精子抗體陽性模型，可為建立抗精子抗體大鼠模型的簡便可靠方法。
　　 2. 精液抗精子抗體可誘導(dǎo)精子凋亡，血清抗精子抗體對(duì)精子凋亡無影響，可為抗精子抗體介導(dǎo)的免疫性不育病因研究提供重要參考。
　　 3. 精液抗精子抗體可導(dǎo)致精子線粒體跨膜電位下降、線粒體細(xì)胞色素c釋放、caspase-3活性上升、線粒體超微結(jié)構(gòu)發(fā)生病理改變以及附睪組織病