胞漿小滴與精子運(yùn)動(dòng)相關(guān)性及參與精子能量代謝機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　精子的運(yùn)動(dòng)功能或運(yùn)動(dòng)能力的強(qiáng)弱直接關(guān)系到人類的生殖能力。只有正常作前向運(yùn)動(dòng)的精子才能確保精子抵達(dá)輸卵管壺腹部與卵子結(jié)合形成受精卵。據(jù)國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道，因精子活力低下而導(dǎo)致的男性不育約占30％。胞漿小滴(Cytoplasmdroplets，CD)是生殖細(xì)胞大部分被支持細(xì)胞所吞噬后細(xì)胞質(zhì)的殘存體，留存于精子頸/體部。作為精子的附屬結(jié)構(gòu)，臨床醫(yī)生認(rèn)為精子CD的殘留是導(dǎo)致精子活力低下的重要原因之一，將CD的存在與不育癥聯(lián)系在一起;

2、而基礎(chǔ)科學(xué)家認(rèn)為CD是有正常功能的精子正常的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。CD的功能及其作用機(jī)理至今仍然不清楚。
　　在絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物物種中，精子成熟的典型特征之一是附睪精子的CD結(jié)構(gòu)從精子中段近端移動(dòng)到遠(yuǎn)端，CD被保存在大多數(shù)哺乳動(dòng)物附睪尾部精子中。近期科學(xué)家們關(guān)于CD的相關(guān)研究已經(jīng)有一些有價(jià)值的發(fā)現(xiàn)，認(rèn)為CD在調(diào)節(jié)精子滲透壓方面起到了重要的作用;在CD中發(fā)現(xiàn)兩種標(biāo)志性物質(zhì)-泛素和15-脂氧化酶;CD中含有的P450芳香化酶與雄激素產(chǎn)生有關(guān)，參與

3、了附睪內(nèi)精子成熟的調(diào)節(jié)等。
　　在精子從附睪頭部相對(duì)靜止的狀態(tài)到射精后精子的超激活運(yùn)動(dòng)，CD經(jīng)歷了從精子中段近端移動(dòng)到遠(yuǎn)端，最后被完全脫去的過程。但是，除了CD能夠調(diào)節(jié)滲透壓之外，CD中究竟包含何種成份、CD通過何種分子途徑影響精子的運(yùn)動(dòng)能力的還需要進(jìn)一步研究，目前尚無相關(guān)報(bào)導(dǎo)。因此，在本研究中，我們通過實(shí)驗(yàn)將明確CD在精子不同成熟時(shí)期及射精后與精子運(yùn)動(dòng)的關(guān)系，同時(shí)深入研究CD的形態(tài)及蛋白組學(xué)構(gòu)成，從而分析精子從睪丸釋放至射精后這

4、一時(shí)間段內(nèi)CD與精子的成熟有何相關(guān)性和作用機(jī)制，從不同角度闡述CD與精子運(yùn)動(dòng)能力的關(guān)系，為男性不育的機(jī)理及臨床診斷與治療提供了新的思路。
　　材料與方法：
　　一、實(shí)驗(yàn)材料
　　1、不同品種（系）(C57BL/6J，F(xiàn)VB，ICR)小鼠選購于中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，為健康雄性及雌性，周齡8-16周。
　　2、電鏡檢測(cè)相關(guān)試劑
　　3、免疫熒光檢測(cè)相關(guān)試劑
　　4、Western Blot相關(guān)試劑

5、>　　5、蛋白質(zhì)譜分析相關(guān)試劑
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　?。ㄒ唬┬∈蟾讲G精子計(jì)數(shù)
　　1、計(jì)數(shù)不同品種（系）小鼠附睪精子在附睪各部位（頭，體，尾）處有CD和無CD結(jié)構(gòu)的精子數(shù)量，并分類計(jì)數(shù)游動(dòng)精子與不游動(dòng)精子數(shù)量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　2、根據(jù)CD在精子的不同位置（頭/頸部、中段、尾部）分類計(jì)數(shù)不同品種（系）(C57BL/6J，F(xiàn)VB，ICR)小鼠的附睪精子，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　?。ǘ┬∈笊渚蟠剖笊车谰?/p>

6、計(jì)數(shù)
　　雌雄鼠交配后，計(jì)數(shù)雌鼠的子宮及陰道內(nèi)精子有CD及無CD精子數(shù)量。
　?。ㄈ┌麧{小滴的提取
　　切取小鼠的附睪，獲取精子懸液。應(yīng)用非連續(xù)性蔗糖密度梯度離心法提取CD的游離體。
　?。ㄋ模┟庖邿晒鈾z測(cè)CD純度
　　CD沉淀加入少量PBS溶液混勻，取出一滴涂片后風(fēng)干。無水乙醇固定3-5分鐘，風(fēng)干。用4％多聚甲醛固定并在4℃含0.5％ Triton X-100 PBS緩沖液中
　　放置2分鐘。一抗

7、（兔抗鼠SPEM1和UBlQUITIN）室溫下加入熒光素標(biāo)記的二抗孵育1小時(shí)，用1×PBS沖洗3次，熒光顯微鏡下觀察CD的純度。
　?。ㄎ澹╇婄R樣本制作
　　將CD提取物離心2次，吸取沉淀物，加入3％-4％戊二醛2ml固定30min，用0.2mol/L磷酸緩沖液離心洗滌3次，沉淀物中加入1％鋨酸處理后，離心沉淀分成2份，一份用1％瓊脂包埋，經(jīng)50％～100％濃度梯度乙醇脫水，環(huán)氧丙烷滲透，過夜。Epon812包埋、切片、醋酸

8、鈾和枸櫞鉛染色、透射電鏡下觀察并拍照。另一份用50％、70％、90％和100％乙醇做梯度脫水，每次15分鐘，離心3000r/min，5分鐘。臨界點(diǎn)干燥后離子濺射儀噴金，時(shí)間80秒、電流15mA、真空7-10Pa，用于掃描電鏡觀察并拍照。
　　（六） Western Blot免疫印跡檢測(cè)
　　使用裂解液分別取各組精子的蛋白質(zhì)，然后SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)印、脫脂奶粉中封閉過夜、一抗（LDHC和PGK2）孵育、辣根過氧化物

9、酶標(biāo)記的二抗孵育以及ECL發(fā)光，成像后進(jìn)行圖像分析。
　?。ㄆ撸┌麧{小滴蛋白質(zhì)譜分析
　　SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白總的精子蛋白、CD蛋白及剩余精子蛋白，使用考馬斯亮蘭染色方法找出CD組中的差異蛋白條帶。切取差異蛋白條帶后，經(jīng)過還原以及使用乙腈進(jìn)行乙酰胺基化處理后，使用ABI4700 MALDI TOF/TOF分析儀分析并收集蛋白數(shù)據(jù)。
　　（八）統(tǒng)計(jì)方法
　　所得數(shù)據(jù)采用SPSS軟件（18.0版）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)

10、分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　一、胞漿小滴與附睪精子運(yùn)動(dòng)的相關(guān)性
　　不同品系小鼠附睪頭部游動(dòng)的精子數(shù)量明顯少于不游動(dòng)精子數(shù)量。精子運(yùn)動(dòng)在附睪體部明顯加強(qiáng)，尾部精子運(yùn)動(dòng)能力最強(qiáng)。精子游動(dòng)組與不游動(dòng)組有CD精子所占的比例有顯著差異(p＜0.01)。說明在附睪精子中CD與精子的運(yùn)動(dòng)有相關(guān)性。
　　二、胞漿小滴在精子上不同位置與精子運(yùn)動(dòng)的相關(guān)性
　　不同品種（系）小鼠附睪頭、體部及尾部

11、游動(dòng)組精子中，CD在精子不同位置所占比例有顯著不同。當(dāng)CD位于精子中部時(shí)，與其他部位相比較有顯著差異(p＜0.01)。說明CD位于精子中部時(shí)與精子的運(yùn)動(dòng)有相關(guān)性。
　　三、交配后雌鼠生殖道內(nèi)精子胞漿小滴被脫去
　　精子射精后進(jìn)入雌鼠生殖道內(nèi)，幾乎只有很少數(shù)量的精子還有CD留存，絕大多數(shù)精子的CD結(jié)構(gòu)消失。說明正常的精子射精后CD被脫去。
　　四、胞漿小滴純化
　　通過非連續(xù)蔗糖密度梯度離心法可以提取得到高純度的C

12、D。鏡檢未見殘存精子?？捎糜谶M(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
　　五、掃描電鏡下胞漿小滴形態(tài)
　　掃描電鏡下CD的形狀幾乎與光鏡下觀察到的CD完全相同。呈球形或雙丸狀，外表不光滑，可見多個(gè)膜樣的小泡，大小不均勻。直徑大約為2μm。六、透射電鏡下胞漿小滴形態(tài)
　　透射電鏡下觀察CD直徑大約為2.3μm，內(nèi)可見膜樣結(jié)構(gòu)，不同CD細(xì)胞基質(zhì)的密度有較大差別。部分CD含有中度電子致密物。但有一些CD的基質(zhì)密度明顯減低，有可能是內(nèi)容物在脫離精子時(shí)丟失

13、。CD的外膜看起來是連續(xù)性的，看不到脫離精子時(shí)膜的破裂。
　　七、Western Blot結(jié)果
　　為了證實(shí)LDHC和PGK2確實(shí)存在于CD中，而且CD中的含量高于精子膜，我們用Western Blot法檢測(cè)全精子、游離的CD和脫去CD后剩余精子的蛋白質(zhì)水平。結(jié)果顯示LDHC在游離的CD和全精子組中含量較高，而PGK2則僅在游離的CD中含量較高。
　　八、蛋白質(zhì)譜分析結(jié)果
　　質(zhì)譜分析檢測(cè)出純化的CD中有105種

14、蛋白，這些蛋白可以被分為8類。其中細(xì)胞骨架蛋白約占8％、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白約占1％、糖蛋白約占1％、熱休克蛋白約占1％、脂蛋白約占3％、核蛋白質(zhì)約占2％，其它稀有蛋白質(zhì)約占9％，而這些蛋白質(zhì)中約68％是酶。
　　結(jié)論：
　　1、當(dāng)精子在附睪成熟過程中，位于精子中段CD的存在是精子成熟過程中的正常結(jié)構(gòu);CD在射精后應(yīng)從精子上正常脫落。
　　2、CD的存在與精子的運(yùn)動(dòng)能力有相關(guān)性，CD存在的位置對(duì)精子運(yùn)動(dòng)有顯著影響，當(dāng)CD位于精子中