小鼠樹突狀細(xì)胞表面新型免疫抑制性受體DIgR2的功能研究.pdf

1、樹突狀細(xì)胞(Dendriticcells，DCs)是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞(Antigen-presentingcells，APCs)，在啟動免疫應(yīng)答和介導(dǎo)免疫耐受過程中起著關(guān)鍵作用。通過DCs表面活化性和抑制性受體傳入胞內(nèi)的各類信號，決定著DCs的狀態(tài)和功能，以至影響著T細(xì)胞應(yīng)答的強(qiáng)度和進(jìn)度。 近來新發(fā)現(xiàn)的一些優(yōu)先表達(dá)于DCs的Ig樣受體分子，作為固有性和獲得性免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)者倍受人們關(guān)注。其中一部分Ig樣分子作為抑制

2、性受體(Inhibitoryreceptor)對免疫應(yīng)答發(fā)揮重要調(diào)控作用。 人CMRF35-A分子是首先由CMRF35-A單抗識別并表達(dá)于淋巴細(xì)胞表面的Ig樣分子，該分子定位于人17號染色體，與附近6個Ig樣分子組成一個緊密相連的基因簇(cluster)。研究表明該基因簇內(nèi)成員參與多方面免疫調(diào)節(jié)作用，如調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞的活化、調(diào)控NK細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞的活性等。此外，位于該基因簇內(nèi)與特應(yīng)性皮炎，關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)

3、性(Singleneucleotidepolyphorism,SNP)更驗證了CMRF35-A及相關(guān)基因在免疫調(diào)控和免疫病理中的重要意義。 本研究根據(jù)人CMRF35-A蛋白序列搜索小鼠EST數(shù)據(jù)庫，獲得相應(yīng)的小鼠同源分子，并由DCs成功克隆得到一個全長為1095bp的新基因序列(accessionNo.AF251703)。該序列包含一個990bp完整開放讀碼框架，編碼含330氨基酸(a.a)的蛋白質(zhì)，預(yù)計分子量為37kDa。對其

4、氨基酸序列分析表明，該蛋白包括一段長21a.a的信號肽，胞外段含有特征性的IgV功能域(domain)，胞內(nèi)含有二個被Tyr-x-x-Met序列相隔的ITIMs基序，提示抑制性信號可經(jīng)此序列向胞內(nèi)傳遞。因此，該分子屬于正在不斷擴(kuò)大的Ig樣抑制性受體家族中的新成員，故將其命名為DIgR2(Dendriticcell-derivedIg-likereceptor2)(與此同時發(fā)現(xiàn)的另一新基因命名為DIgR1)。 我們分別采用Nort

5、hern印跡和RT-PCR分析了DIgR2的組織細(xì)胞分布特點(diǎn)。結(jié)果表明，DIgR2廣泛分布于小鼠正常組織，在心、腦、肝、肺、腎及脾等組織均有不同程度表達(dá)，其中尤以心臟表達(dá)水平最高。而在細(xì)胞株及小鼠新鮮分離細(xì)胞中，DIgR2主要分布于單核細(xì)胞，DCs及B細(xì)胞，尤其在DCs表達(dá)顯著，但未見于T細(xì)胞。實(shí)時定量熒光PCR檢測表明，DIgR2水平隨DCs分化、成熟而不斷增加，并且LPS、IL-10可促進(jìn)其表達(dá)，CD40L卻下調(diào)其表達(dá)。 進(jìn)

6、一步我們研究了DIgR2的生化特性。我們分別檢測了氧化條件或還原條件下DIgR2轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞NIH3T3后的表達(dá)情況。結(jié)果顯示在這兩種情況下，DIgR2均表達(dá)為約60kD的條帶。而將轉(zhuǎn)染細(xì)胞用N-glycosidaseF進(jìn)行去糖基化處理后，DIgR2條帶顯示為預(yù)期分子量37kD，表明DIgR2分子在真核細(xì)胞內(nèi)可被高度糖基化，但不形成同源或異源型二聚體。接著我們以Confocal顯微鏡進(jìn)行了DIgR2的細(xì)胞定位研究，結(jié)果可見熒光信號均勻分

7、布于轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面，證實(shí)DIgR2確為一表面分子。 深入研究DIgR2生物學(xué)功能關(guān)鍵步驟是搜尋其相應(yīng)配體。由于DIgR2分子優(yōu)先表達(dá)于單核細(xì)胞、B細(xì)胞及DCs這些與抗原呈遞細(xì)胞，而且在DCs上更具有誘導(dǎo)性表達(dá)的特征，我們推測DIgR2可能參與免疫細(xì)胞之間的相互作用。因此，我們用純化DIgR2-Fc蛋白首先搜尋淋巴細(xì)胞以確定可能表達(dá)其配體的細(xì)胞，結(jié)果顯示DIgR2-Fc蛋白可特異性結(jié)合T細(xì)胞，而人免疫球蛋白(hIg)未見結(jié)合，且該特

8、異性結(jié)合可被過量GST-DIgR2融合蛋白競爭性抑制，提示T細(xì)胞表面存在DIgR2的相應(yīng)配體，而且DIgR2與其配體的結(jié)合可能參與DC-T細(xì)胞之間相互作用。 那么DIgR2是否真正參與了DC-T細(xì)胞之間的相互作用呢?DCs一個顯著的特點(diǎn)是刺激同種T細(xì)胞增殖，我們在C57/B6(H2-Kb)DC與BalB/c(H2-Kd)CD4+T細(xì)胞混合反應(yīng)體系中加入足量可溶性DIgR2-Fc蛋白來阻斷DIgR2與T細(xì)胞相互作用，結(jié)果顯示，DI

9、gR2-Fc蛋白的加入使DCs誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖明顯增加。為了消除DIgR2-Fc蛋白可能具有的直接對T細(xì)胞的影響，我們采用了另一實(shí)驗方案——利用siRNA技術(shù)來干擾DCs上DIgR2的表達(dá)。將這些DIgR2被干擾的DCs(DIgR2-siRNA-DCs)與同種異基因(allogenic)T細(xì)胞混合后，與對照DIgR2-mut-siRNA-DCs相比，DIgR2-siRNA-DCs亦明顯促進(jìn)T細(xì)胞的增殖，同樣證明DIgR2在DC-T相互作

10、用中具有一定的負(fù)調(diào)節(jié)功能。 為進(jìn)一步研究DIgR2對DCs啟動(prime)的抗原特異性免疫應(yīng)答產(chǎn)生的影響，我們以特異性針對OVAⅡ肽(323-339a.a)的TCR轉(zhuǎn)基因小鼠T細(xì)胞(D011.10)作為應(yīng)答細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染siRNA，并載有OVAⅡ肽的DCs作為刺激細(xì)胞。在這二者混合培養(yǎng)體系中，與DIgR2-mut-siRNA-DCs相比，DIgR2-siRNA-DCs明顯促進(jìn)抗原特異性T細(xì)胞的增殖。而且ELISA檢測及胞內(nèi)染色都

11、顯示，DIgR2-siRNA-DCs刺激CD4+T細(xì)胞分泌的IFN-γ與IL-2顯著增加，表明DIgR2不但影響了DCs誘導(dǎo)的T細(xì)胞的增殖，而且也影響了T細(xì)胞的活化和分化。為進(jìn)一步檢測DIgR2在體內(nèi)是否具有免疫抑制功能，我們將DIgR2-siRNA-DCs回輸至已輸有抗原肽特異的CD4+T細(xì)胞的小鼠體內(nèi)。結(jié)果顯示，抗原肽特異T細(xì)胞(kj1-26+)數(shù)量在DIgR2-silencedDCs回輸?shù)男∈笃⑴K中顯著增加，說明DIgR2分子的下

12、調(diào)促進(jìn)了DCs誘導(dǎo)抗原肽特異性CD4+T細(xì)胞增殖的能力，進(jìn)一步為DIgR2的負(fù)向免疫調(diào)節(jié)活性提供了體內(nèi)依據(jù)。 上述數(shù)據(jù)顯示了DIgR2在免疫應(yīng)答中具有一定負(fù)向調(diào)節(jié)功能，那么DIgR2的這種調(diào)節(jié)作用是通過何種方式實(shí)現(xiàn)的呢?表達(dá)于T細(xì)胞的配體分子是否通過與DIgR2的相互作用影響DCs狀態(tài)和功能呢?在上述反應(yīng)體系中，當(dāng)我們將DIgR2-siRNA-DCs表型、細(xì)胞因子譜與對照DCs相比時，發(fā)現(xiàn)DIgR2-siRNA-DCs產(chǎn)生的IL

13、-12p70水平顯著增加，鑒于IL-12在觸發(fā)T細(xì)胞分泌IFN-γ及促進(jìn)初始T細(xì)胞向Th1極化過程中的重要作用，推測下調(diào)DIgR2引起的DCs表達(dá)IL-12p70水平的增加，可能是引起后續(xù)T細(xì)胞增殖及IFN-γ分泌增加的原因之一。 為更明確地揭示DIgR2在小鼠體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)活性，我們進(jìn)一步研究了DIgR2-silenced-DCs免疫小鼠后激發(fā)的免疫應(yīng)答的特點(diǎn)。首先我們建立了可有效轉(zhuǎn)染并干擾DCs上DIgR2表達(dá)的腺病毒重組載

14、體(Adenoviralvector，AV)，并以AV-DIgR2-siRNA及對照AV-DIgR2-mut-siRNA分別感染DCs，同時將OVA抗原負(fù)載于DCs，并以LPS刺激其成熟。將上述DCs免疫小鼠，二周后取其脾細(xì)胞以檢測免疫功能。結(jié)果顯示，與對照AV-DIgR2-mut-siRNA-DCs相比，AV-DIgR2-siRNA-DCs誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的Th1型細(xì)胞因子IFN-γ；相應(yīng)地CD8+T細(xì)胞應(yīng)答水平也有顯著提高，表現(xiàn)為O

15、VA特異性(OVA-tetramer+)CD8+T細(xì)胞比例上升，CD8+T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ水平增加，而且OVA特異性CTL殺傷效應(yīng)亦明顯增強(qiáng)。 另一方面，以負(fù)載抗原的成熟DCs免疫小鼠可有效活化抗原特異性CTL，但其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的抗腫瘤免疫目前仍未達(dá)到令人滿意的效果，封閉DCs上DIgR2介導(dǎo)的抑制性信號通路是否可增強(qiáng)DCs腫瘤疫苗的免疫效果呢?為此我們?nèi)∩鲜鼋?jīng)過特異性干擾腺病毒(silencerAV)感染，并負(fù)載有OVA抗原

16、，體外LPS刺激成熟的DCs免疫小鼠兩次，然后接種EG7.OVA淋巴瘤細(xì)胞。結(jié)果顯示，接種腫瘤24天后，AV-DIgR2-siRNA-DCs免疫小鼠中腫瘤生長明顯小于對照DCs及AV-DIgR2-mut-siRNA-DCs小鼠。而且，直至腫瘤接種60天，AV-DIgR2-siRNA-DCs免疫小鼠中60％都未長腫瘤，而其余兩組小鼠(DCs及AV-DIgR2-mut-siRNA-DCs)只有20％獲得完全保護(hù)。 綜上所述，本研究對

17、屬于Ig家族的抑制性受體的新分子DIgR2的生物學(xué)功能進(jìn)行了深入研究。DIgR2胞內(nèi)區(qū)含有二個ITIM基序，具有與SHP-1結(jié)合能力。以DIgR2-Fc可溶性蛋白及特異性siRNA封閉DCs上DIgR2的表達(dá)，可促進(jìn)DCs誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖，并且促進(jìn)抗原特異性免疫應(yīng)答。進(jìn)一步以抗原沖擊的DIgR2-silenced-DCs免疫小鼠，能夠更顯著地激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，并可保護(hù)小鼠免于腫瘤發(fā)生和進(jìn)展。我們的研究提供了