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文檔簡介
1、人白細胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體1(1eukocyte-associatedimmunoglobulin-likereceptor-1,LAIR-1)是1997年基因克隆成功的分子,在2004年底舉行的第八屆國際人類白細胞分化抗原大會上獲準(zhǔn)了新的CD編號(CD305)。自從1983年發(fā)現(xiàn)該分子以來,已證明其是與免疫功能密切相關(guān)的抑制性受體,能夠抑制多種免疫細胞的功能。研究發(fā)現(xiàn),LAIR-1具有廣泛的組織分布,并在造血細胞的分化、增殖中起重要
2、的調(diào)節(jié)作用,是一個具有重要生物學(xué)功能及臨床潛在應(yīng)用前景的分子。 小鼠LAIR-1(murineLAIR-1,mLAIR-1)是人LAIR-1(humanLAIR-1,hLAIR-1)基因在小鼠體內(nèi)的同源物,其序列在氨基酸水平與人LAIR-1分子有40%同源性,2002年我室首次從小鼠胸腺中成功克隆該基因(GenBankAF479685)。小鼠LAIR-1基因位于小鼠7號染色體上,共編碼263個氨基酸,胞膜外區(qū)也含有1個免疫球蛋白
3、(Ig)樣結(jié)構(gòu)域,故屬于免疫球蛋白超家族(IgSF)成員,胞質(zhì)區(qū)含有2個ITIM(immunoreceptortyrosine-basedinhibitorymotif)樣基序。探討LAIR-1在人與鼠表達的異同點,有助于對該分子生物學(xué)功能的進一步認(rèn)識,也有助于了解其在生物進化過程中所發(fā)生的變化。本博士論文是基于hLAIR-1分子研究的基礎(chǔ)上,對mLAIR-1分子的表達、分布及其功能進行了初步的研究。 抗體是新分子分布和功能研究
4、的有力工具,由于針對小鼠胞膜分子鼠源性單克隆抗體(monoclonalantibody,mAb)制備的成功率較低,到目前為止國內(nèi)外仍未有商品化的針對mLAIR-1的mAb,因此凸顯出制備高質(zhì)量的多克隆抗體(polyclonalantibody,PoAb)的重要性。為此,我們首先構(gòu)建了表達mLAIR-1-Fc融合蛋白的載體,轉(zhuǎn)染CHO細胞,建立了穩(wěn)定表達mLAIR-1-Fc融合蛋白的細胞株,用proteinA親和層析柱純化mLAIR-1-
5、Fc融合蛋白。然后用融合蛋白交聯(lián)CNBr-Sepharose4B凝膠制備成親和層析柱,從免疫兔血清中純化針對小鼠LAIR-1的多克隆抗體,通過純化,獲得純度高、特異性強的多克隆抗體。ELISA和SDS-PAGE鑒定結(jié)果表明該抗體具有良好的生物學(xué)活性和較高的純度。經(jīng)間接免疫熒光染色、FCM和Westernblot分析,該抗體能識別mLAIR-1分子,證實我們制備的兔抗mLAIR-1胞外區(qū)的抗體具有良好的特異性和生物學(xué)活性,為下一步的研究工
6、作奠定了基礎(chǔ)。 采用間接免疫熒光染色,對多種細胞系進行流式細胞術(shù)分析并觀察mLAIR-1的分布發(fā)現(xiàn),LAIR-1的分布及表達水平隨細胞系的不同而變化,以小鼠成纖維細胞系和髓樣細胞系表達水平最高。 免疫熒光染色及免疫組化結(jié)果提示,mLAIR-1參與了中樞免疫器官和外周免疫器官的造血等過程。免疫熒光染色顯示,在中樞免疫器官中,mLAIR-1在骨髓B細胞上表達水平較高,并可能參與了胸腺T細胞的發(fā)育過程;在脾臟中,相對T細胞來講
7、,成熟的B細胞、NK細胞和巨噬細胞上mLAIR-1表達水平較高。免疫組化結(jié)果顯示,mLAIR-1在胸腺不成熟的皮質(zhì)區(qū)中有散在的分布,而在皮髓質(zhì)交界處以及髓質(zhì)區(qū)有較明顯的表達。在脾臟中,mLAIR-1主要表達在紅髓,白髓也有一定水平的表達。 T細胞在胸腺中發(fā)育成熟,這一過程依賴于胸腺的微環(huán)境。調(diào)控胸腺細胞正常發(fā)育的微環(huán)境包括兩個方面,一是來自胸腺基質(zhì)細胞分泌的細胞因子和激素,二是通過黏附分子的相互作用為胸腺細胞提供活化或抑制的信號
8、。胸腺細胞膜分子與胸腺微環(huán)境基質(zhì)細胞相應(yīng)配體相互作用調(diào)節(jié)胸腺細胞發(fā)育的研究日益受到重視。我們利用胸腺器官培養(yǎng)(fetalthymusorganculture,F(xiàn)TOC)實驗?zāi)P?,用mLAIR-1融合蛋白在體外干預(yù)胎鼠胸腺的發(fā)育,觀察到加入mLAIR-1-Fc融合蛋白后,胸腺細胞總數(shù)明顯增加,細胞各亞群的數(shù)目也發(fā)生了變化,尤其是CD4+CD8+雙陽性細胞亞群增長最為明顯。 以小鼠LAK(lymphokine-activatedki
9、llercells)細胞為模型,采用重導(dǎo)向殺傷試驗(redirectedcytotoxicityassay,RCA)證實了mLAIR-1分子在小鼠體內(nèi)起抑制殺傷的作用。 采用Westernblot鑒定了三種小鼠重要的磷酸酶SHP-1、SHP-2和SHIP的mAb,并用FPLC陰離子交換層析純化了該系列mAb。利用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP)的方法檢測到mLAIR-1募集的磷酸酶可能是SH
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