高表達(dá)Omi-HtrA2并siRNA沉默PED-PEA-15基因?qū)η傲邢侔┥飳W(xué)行為的影響.pdf

1、一、PED/PEA-15在前列腺癌中的表達(dá)及意義 目的：檢測(cè)PED/PEA-15在人前列腺癌組織和細(xì)胞(PC-3)中的表達(dá)，探討PED/PEA-15在前列腺癌中表達(dá)的意義。方法：應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)前列腺癌和正常前列腺組織中PED/PEA-15的表達(dá)；用RT-PCR法檢測(cè)PC-3細(xì)胞中PED/PEA-15的表達(dá)。結(jié)果：免疫組化和RT-PCR均顯示PED/PEA-15在前列腺癌中高表達(dá)；正常前列腺組織沒有或只有少量很弱的表達(dá)。結(jié)

2、論：抗凋亡因子PED/PEA-15的表達(dá)對(duì)前列腺癌的發(fā)展有重要作用。 二、PED/PEA-15真核表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)前列腺癌細(xì)胞凋亡的影響 目的：構(gòu)建PED/PEA-15真核表達(dá)載體，探討PED/PEA-15對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡的影響。方法：用RT-PCR法從PC-3中擴(kuò)增出PED/PEA-15全長(zhǎng)基因，以pEGFP-N1為載體構(gòu)建其真核表達(dá)質(zhì)粒。以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染PED/PEA-15真核表達(dá)載體至前列腺癌細(xì)胞(PC-3)中，

3、用流式細(xì)胞和MTT法檢測(cè)PED/PEA-15對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)的影響。結(jié)果：酶切和DNA測(cè)序證實(shí)PED/PEA-15的真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)染PED/PEA-15真核載體的PC-3細(xì)胞凋亡下調(diào)，且對(duì)腫瘤殺傷因子KillerTRAIL的敏感性亦下降。結(jié)論：抗凋亡因子PED/PEA-15可阻抑前列腺癌細(xì)胞(PC-3)的凋亡，PED/PEA-15的表達(dá)對(duì)前列腺癌的發(fā)展有重要作用。 三、siRNA沉默PED/PEA-15對(duì)前列腺

4、癌細(xì)胞凋亡的影響 目的：通過構(gòu)建PED/PEA-15特異的siRNA載體，探討PED/PEA-15對(duì)前列腺癌細(xì)胞(PC-3)凋亡的影響。方法：利用Invivogen公司的軟件輔助設(shè)計(jì)PED/PEA-15特異性siRNA序列并體外合成后，克隆入真核表達(dá)載體psiRNA-hH1neo。以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染psiRNA-PED/PEA-15至PC-3細(xì)胞中，以RT-PCR和Westernblot法檢測(cè)psiRNA-PED/PEA-15對(duì)PE

5、D/PEA-15表達(dá)的影響；用MTT和流式細(xì)胞法檢測(cè)其對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果：酶切和DNA測(cè)序證實(shí)合成的siRNA基因序列正確，并已被準(zhǔn)確克隆入psiRNA-hH1neo載體。psiRNA-PED/PEA-15可特異性抑制PC-3細(xì)胞中PED/PEA-15的表達(dá)。轉(zhuǎn)染psiRNA-PED/PEA-15的PC-3細(xì)胞凋亡顯著增加(P＜0.05)。結(jié)論：PED/PEA-15可阻抑前列腺癌細(xì)胞凋亡，PED/PEA-15的表達(dá)對(duì)前列腺癌

6、的發(fā)展有重要作用。 四、抗凋亡因子XIAP和PED/PEA-15在前列腺癌(PC-3)中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 目的：檢測(cè)抗凋亡因子XIAP與PED/PEA-15在前列腺癌細(xì)胞(PC-3)中的表達(dá)，探討二者對(duì)前列腺癌細(xì)胞凋亡的影響。方法：應(yīng)用半定量RT-PCR法檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞(PC-3)中PED/PEA-15和XIAP的表達(dá)。設(shè)計(jì)并構(gòu)建PED/PEA-15和XIAP特異的siRNA載體，以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染二者的siRNA

7、載體至前列腺癌細(xì)胞(PC-3)中，半定量RT-PCR法檢測(cè)特異siRNA載體對(duì)PED/PEA-15和XIAP轉(zhuǎn)錄的影響；光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變；流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化。結(jié)果：半定量RT-PCR顯示PED/PEA-15和XIAP均在前列腺癌細(xì)胞(PC-3)中高表達(dá)。酶切和DNA測(cè)序證實(shí)XIAP和PED/PEA-15的siRNA載體構(gòu)建成功。共轉(zhuǎn)染XIAP和PED/PEA-15的siRNA載體入PC-3細(xì)胞，可導(dǎo)致XIAP和PED/PE

8、A-15的轉(zhuǎn)錄抑制，并增加PC-3細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性凋亡亦明顯增加，處理組凋亡率為79％對(duì)照組為46％(p＜0.05)。結(jié)論：PED/PEA-15和XIAP在前列腺癌細(xì)胞的凋亡中有重要作用。 六、Omi/HtrA2促前列腺癌細(xì)胞(PC-3M)凋亡的實(shí)驗(yàn)研究 目的：檢測(cè)人前列腺癌細(xì)胞(PC-3M)中Omi/HtrA2的表達(dá)情況，并構(gòu)建其小干擾RNA(siRNA)表達(dá)載體，探討Omi/HtrA2對(duì)PC-3M凋亡的影響。方法

9、：以細(xì)胞免疫組化和RT-PCR法檢測(cè)Omi/HtrA2在前列腺癌細(xì)胞系(PC-3M)和正常前列腺細(xì)胞中的表達(dá)。利用Invivogen公司的軟件輔助設(shè)計(jì)Omi/HtrA2特異性siRNA序列，體外合成后將其克隆入真核表達(dá)載體psiRNA-hH1neo。以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染psiRNA-Omi/HtrA2載體至PC-3M中，以RT-PCR和Westernblot法檢測(cè)psiRNA-Omi/HtrA2對(duì)Omi/HtrA2轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的沉默效應(yīng)。用MT

10、T和流式細(xì)胞法檢測(cè)siRNA導(dǎo)致Omi/HtrA2基因沉默后，PC-3M細(xì)胞凋亡的變化。結(jié)果：細(xì)胞免疫組化和RT-PCR均顯示Omi/HtrA2在PC-3M細(xì)胞中高表達(dá)。酶切和DNA測(cè)序證實(shí)合成的siRNA基因序列正確，并已被準(zhǔn)確克隆入psiRNA-hH1neo載體中。psiRNA-Omi/HtrA2載體可特異性抑制PC-3M細(xì)胞中Omi/HtrA2的表達(dá)。轉(zhuǎn)染psiRNA-Omi/HtrA2載體的PC-3M細(xì)胞凋亡下調(diào)。結(jié)論：促凋亡因

11、子Omi/HtrA2可導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞凋亡，Omi/HtrA2的表達(dá)對(duì)前列腺癌的發(fā)展有重要作用。 七、Omi/HtrA2抑制PED/PEA-15促前列腺癌細(xì)胞(PC-3)凋亡的研究背景與目的：促、抑凋亡因子間的相互作用與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，Omi/HtrA2是新近發(fā)現(xiàn)的一種凋亡調(diào)節(jié)因子，PED/PEA-15是一種廣泛表達(dá)的抗凋亡蛋白，本研究旨在探討Omi/HtrA2對(duì)PED/PEA-15表達(dá)和前列腺癌細(xì)胞(PC-3)凋亡的

12、影響。方法：構(gòu)建Omi/HtrA2的表達(dá)載體和siRNA載體，并用脂質(zhì)體法將二載體分別轉(zhuǎn)染至PC-3細(xì)胞中，Westernblot和ELISA法檢測(cè)Omi/HtrA2對(duì)PED/PEA-15表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響；caspase-8檢測(cè)試劑盒檢測(cè)PED/PEA-15對(duì)caspase-8活性的影響；Westernblot、RT-PCR檢測(cè)Omi/HtrA2特異siRNA序列對(duì)其轉(zhuǎn)錄、翻譯的影響，流式細(xì)胞法檢測(cè)siRNA導(dǎo)致Omi/HtrA2基

13、因沉默后，PC-3細(xì)胞凋亡的變化。結(jié)果：酶切和DNA測(cè)序證實(shí)Omi/HtrA2的表達(dá)載體和siRNA載體構(gòu)建成功。通過轉(zhuǎn)染Omi/HtrA2表達(dá)載體高表達(dá)Omi/HtrA2可抑制PED/PEA-15表達(dá)，并增加腫瘤細(xì)胞的凋亡率；抑制PED/PEA-15的表達(dá)可提高caspase-8活性。siRNA導(dǎo)致Omi/HtrA2基因沉默后PC-3細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性降低。結(jié)論：Omi/HtrA2可通過抑制抗凋亡蛋白PED/PEA-15表達(dá)而在PC細(xì)

14、胞凋亡中發(fā)揮重要作用。 八、高表達(dá)Omi/HtrA2對(duì)PED/PEA-15表達(dá)缺陷的前列腺癌細(xì)胞凋亡的影響 目的探討Omi/HtrA2促前列腺癌細(xì)胞凋亡機(jī)制，找尋前列腺癌治療新方法。方法分別構(gòu)建促凋亡因子Omi/HtrA2的真核表達(dá)載體、抗凋亡蛋白PED/PEA-15的特異siRNA載體。用脂質(zhì)體法將PED/PEA-15的siRNA載體轉(zhuǎn)染入前列腺癌細(xì)胞(PC-3)中，經(jīng)G418篩選獲得抗性亞克隆細(xì)胞株，RT-PCR、W

15、esternblot法對(duì)亞克隆細(xì)胞株進(jìn)行PED/PEA-15基因鑒定。將Omi/HtrA2表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入亞克隆細(xì)胞株，流式細(xì)胞儀檢測(cè)高表達(dá)Omi/HtrA2對(duì)亞克隆細(xì)胞株凋亡的影響。結(jié)果酶切和DNA測(cè)序證實(shí)Omi/HtrA2表達(dá)載體和PED/PEA-15特異siRNA載體構(gòu)建成功。G418篩選出的亞克隆細(xì)胞株中PED/PEA-15的表達(dá)極弱。在亞克隆細(xì)胞株中高表達(dá)Omi/HtrA2細(xì)胞凋亡率較高、XIAP的抑制亦更明顯。結(jié)論抗凋亡蛋白P