前列腺癌中高表達的CtBP2基因?qū)毎鲋车挠绊?pdf

1、目的：探討CtBP2在前列腺癌及良性前列腺增生組織中的表達狀況，并確定其與臨床病理特征及患者預(yù)后的關(guān)系。再運用短發(fā)卡RNA(shRNA)干擾技術(shù)沉默前列腺癌細胞中的CtBP2基因，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。進一步研究靶向沉默CtBP2后細胞增殖能力的變化。
　　 方法：⑴應(yīng)用免疫組織化學(xué)法（SABC法）檢測CtBP2在160例前列腺癌組織和60例良性前列腺增生組織中的表達情況，并與Gleason評分、臨床分期等臨床病理特征進行統(tǒng)計學(xué)分

2、析。結(jié)合免疫組化研究結(jié)果及患者臨床隨診資料，對它們之間的關(guān)系進行Kaplan-Meier生存分析及多變量Cox回歸分析。⑵利用qPCR和Western-blot篩選出CtBP2表達水平最高的前列腺癌細胞系作為研究對象。經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)分別將三個針對不同位點的CtBP2-shRNA表達載體轉(zhuǎn)染入CtBP2表達最高的前列腺癌細胞系中，通過RT-PCR及Western印跡法篩選出干擾效果最佳的質(zhì)粒。⑶經(jīng)嘌呤霉素篩選及克隆化培養(yǎng)后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CtB

3、P2-shRNA的細胞株。應(yīng)用qPCR和Western印跡法分別檢測轉(zhuǎn)染前后細胞中CtBP2在mRNA以及蛋白水平的表達情況。⑷運用細胞計數(shù)法、細胞克隆形成實驗及MTT法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CtBP2-shRNA真核表達載體前后前列腺癌細胞的增殖能力。
　　 結(jié)果：①通過免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌組織中CtBP2蛋白高表達率為86％(138/160)，表達水平較良性前列腺增生組織顯著升高（P＜0.05）;CtBP2的表達與腫瘤臨床分期

4、(P=0.025)、Gleason評分(P=0.019)及PSA水平（P=0.018）密切相關(guān)。通過Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)CtBP2的表達水平與前列腺癌患者生存時間顯著負相關(guān)（P=0.027）。多變量Cox回歸分析顯示CtBP2表達水平是患者預(yù)后的獨立預(yù)測因子(P=0.043)。②采用qPCR和Western blot方法檢測了正常前列腺上皮細胞（RWPE-1）、PC3、LNCaP3個細胞系中CtBP2的表達水平，結(jié)果顯示

5、其表達水平高低順序依次為RWPE-1＜LNCaP＜PC3。將CtBP2-shRNA表達載體成功轉(zhuǎn)染入PC3細胞，靶向838-857位點干擾質(zhì)粒1(CtBP2-shRNA-1)比干擾質(zhì)粒2和3具有更強的CtBP2基因沉默效應(yīng)(P＜0.05)。成功建立穩(wěn)定表達CtBP2-shRNA-1的PC3細胞系。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后PC3細胞中CtBP2在mRNA以及蛋白水平的表達較轉(zhuǎn)染前明顯降低(P＜0.05)。③細胞計數(shù)及MTT實驗結(jié)果表明Silence組（

6、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CtBP2-shRNA-1真核表達載體的PC3細胞）與Vector組（穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒PC3細胞）、Blank control組（正常PC3細胞）相比較，其增殖水平于培養(yǎng)第2天開始有統(tǒng)計學(xué)差異，實驗組細胞增殖水平降低(P＜0.05)。④細胞克隆形成實驗結(jié)果顯示Blank Control組、Vector組和Silence組PC3細胞培養(yǎng)12天后可見克隆數(shù)分別為136±11、128±12和56±9，Silence組細胞克隆形成直徑明顯

7、小于其他兩組，Silence組PC3細胞的集落形成抑制率達到了59.8％。
　　 結(jié)論：前列腺癌組織中CtBP2高表達，并與前列腺癌的高Gleason評分、高臨床分期、高PSA水平以及患者不良預(yù)后密切相關(guān)。靶向CtBP2 mRNA838-857位點的干擾質(zhì)粒能夠有效的在轉(zhuǎn)錄后水平抑制前列腺癌細胞CtBP2基因的表達，并使前列腺癌細胞增殖能力明顯下降。這些實驗結(jié)果表明CtBP2表達增加與前列腺癌惡性生物學(xué)行為相關(guān)，是前列腺癌發(fā)生進