前列腺癌組織膽堿攝取值與其腫瘤生物學(xué)行為相關(guān)性的初步研究.pdf

1、第一部分，前列腺癌組織膽堿攝取值與其腫瘤生物學(xué)行為相關(guān)性的初步研究
　　 研究背景及目的：
　　 惡性腫瘤細(xì)胞的分裂增生非常旺盛，因而細(xì)胞膜的生物合成也非?；钴S。理論上，作為細(xì)胞膜構(gòu)成上的重要組分的膽堿在體內(nèi)的攝取、代謝情況可以反映腫瘤組織細(xì)胞的增殖情況，從而與其腫瘤生物學(xué)行為相關(guān)。經(jīng)同位素11C標(biāo)記的膽堿也因此被發(fā)展成為一種核醫(yī)學(xué)檢查的示蹤劑，用于對(duì)惡性腫瘤的診斷與鑒別診斷。然而該法在臨床實(shí)際應(yīng)用于初診前列腺癌顯像過程

2、時(shí)，膽堿在惡性腫瘤組織中的標(biāo)準(zhǔn)攝取值(standarduptakevalue，SUV)往往個(gè)體差異非常大，且其數(shù)值往往受多種因素影響，甚至單憑膽堿攝取值難以有效鑒別前列腺良惡性病變，因此關(guān)于其在前列腺癌診斷中的意義存在爭(zhēng)議。有鑒于此，在本項(xiàng)研究中，我們應(yīng)用11C_膽堿PET/CT技術(shù)對(duì)前列腺癌進(jìn)行顯像中，同時(shí)記錄前列腺癌病灶膽堿最大SUV值(SUVmax)以及同層臀大肌SUVmax值，以后者為背景計(jì)算其比值SUVmax-P/M值。以SU

3、Vmax及SUVmax-P/M值作為描述前列腺癌病灶膽堿攝取的指標(biāo)，分析其與患者腫瘤病理分級(jí)、分期以及多個(gè)腫瘤生物學(xué)行為分子標(biāo)記物表達(dá)情況的相關(guān)性，探討膽堿攝取在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的意義，并進(jìn)一步評(píng)估11C-膽堿核素顯像技術(shù)在前列腺癌的診治中的應(yīng)用價(jià)值。
　　 研究方法：
　　 1.病例資料共計(jì)26例于2007年四月-2010年三月接受11C_膽堿PET/CT的前列腺癌患者納入本項(xiàng)研究，均經(jīng)超聲引導(dǎo)下的經(jīng)直腸前列腺穿刺組

4、織活檢術(shù)證實(shí)為前列腺癌。26例患者平均年齡67.1歲，按照AJCC(2002)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期，其中Ⅱ期患者10例，Ⅲ期患者5例，Ⅳ期患者11例。Gleason積分平均7.2±1.3，7(4+3)分及以上者14例。所有患者在接受PET/CT檢查前均未行雄激素阻斷治療以及其他任何有創(chuàng)性操作，前列腺組織活檢于PFT/CT檢查完成后進(jìn)行，且以PET/CT顯像結(jié)果為參照，對(duì)可疑病灶區(qū)域予以重點(diǎn)穿刺取樣，留取前列腺癌組織標(biāo)本。
　　 2.

5、11C_膽堿PET/CT顯像及數(shù)據(jù)分析11C-膽堿的制備由GEMINItrace回旋加速器生產(chǎn)11C，采用固相一步法全自動(dòng)方法合成11C-膽堿。患者于靜脈注射7.4MBq/kg11C-膽堿5分鐘后行仰臥位PET/CT顯像。行4排螺旋CT掃描后，PET采用2D掃描，采集2個(gè)床位（盆腔），可疑轉(zhuǎn)移患者采集6個(gè)床位（全身）。PET數(shù)據(jù)經(jīng)OSEM重建，通過Xeleris工作站進(jìn)行圖像融合分別得到冠狀、矢狀、橫斷的CT、PET及PET/CT融合圖

6、像。
　　 在前列腺病灶濃聚灶部位按病灶形狀勾畫感興趣區(qū)(regionofinterest，ROI)，計(jì)算并記錄出該部位的最大標(biāo)準(zhǔn)攝取值(SUVmax);同法在病灶同層面臀大肌測(cè)量SUVmax，并計(jì)算其與前列腺病灶SUVmax的比值即SUVmax-P/M值。
　　 3.免疫組織化學(xué)檢測(cè)前列腺組織石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化、高溫抗原修復(fù)后，按照Envision二步法對(duì)Ki-67、雄激素受體、CD31、Her-2/neu、PTEN

7、和Bcl-2進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，并對(duì)結(jié)果予以定量/半定量評(píng)分或定性評(píng)價(jià)。
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析將11C-膽堿PET/CT結(jié)果，包括前列腺病灶SUVmax以及SUVmax-P/M值，與患者臨床病理資料及免疫組化檢測(cè)結(jié)果的關(guān)系以SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.26例患者前列腺癌病灶SUVmax值平均為9.42±6.70(1.69-24.65)，SUVmax-P/M值平均為4.33±1.

8、41(1.18-7.44)。如以SUVmax-P/M值2.3為診斷前列腺癌的界值，其診斷敏感度為88.6％。Ⅱ期與Ⅲ期患者間SUVmax值與SUVmax-P/M值均無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但兩者在Ⅳ期患者中均顯著升高。Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示SUVmax值與SUVmax-P/M值與Gleason積分均無明顯相關(guān)性，但是在Gleason積分7分(4+3)及以上的患者組的SUVmax-P/M值顯著的高于Gleason積分7分(3+4)及

9、以下的患者組，而兩組的SUVmax值無明顯差異。
　　 2.26例患者以Ki-67標(biāo)記增殖指數(shù)平均為10.4±13.1(0-48)，以CD31標(biāo)記計(jì)算微血管密度(MVD)平均為26.4±11.8(7-48)，雄激素受體半定量評(píng)分平均為86.5±61.8(0-180)。Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示SUVmax-P/M值與增殖指數(shù)、MVD值均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，而與雄激素受體表達(dá)情況無明顯相關(guān);SUVmax值則與上述指標(biāo)均無相關(guān)性

10、。26例患者中判定為Her-2/neu，Bcl-2及PTEN表達(dá)陽(yáng)性的患者分別為6例，13例及11例。其中Her-2/neu表達(dá)陽(yáng)性的患者SUVmax-P/M值明顯高于陰性的患者，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Bcl-2及PTEN表達(dá)呈陽(yáng)性及陰性組間SUVmax-P/M值無明顯差異。SUVmax值在此3個(gè)指標(biāo)表達(dá)陽(yáng)性及陰性組中均無明顯差異。
　　 研究結(jié)論：
　　 以同層肌肉SUVmax值校正后的前列腺癌病灶膽堿攝取值SUVmax-P

11、/M值與前列腺癌患者的臨床分期、Gleason積分以及Ki-67等指標(biāo)表達(dá)間均有一定的相關(guān)性，能較好反映前列腺癌的腫瘤生物學(xué)行為。以SUVmax-P/M值作為描述前列腺癌組織膽堿攝取情況的指標(biāo)，可為前列腺癌患者臨床分期、腫瘤惡性程度、治療方案選擇以及預(yù)后估計(jì)等多個(gè)方面提供有益信息，具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　 第二部分，鈣調(diào)蛋白拮抗劑小檗胺抗前列腺癌作用機(jī)制的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究
　　 研究背景及目的：
　　 前列腺

12、癌是目前西方國(guó)家男性最為常見的惡性腫瘤之一,近年來隨著我國(guó)生活水平的上升和飲食生活習(xí)慣的西化,前列腺癌的發(fā)病率也在快速上升,現(xiàn)已位居泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病率的第三位,但與西方不同,我國(guó)大多數(shù)前列腺癌患者就診時(shí)譯處于晚期,無法行手術(shù)根治性切除,只能采用內(nèi)分泌治療為主的藥物治療。其機(jī)理主要是通過阻斷阻斷雄激素分泌以及對(duì)抗雄激素作用,從而抑制受雄激素促進(jìn)的腫瘤細(xì)胞增殖、以及誘導(dǎo)雄激素依賴性腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。但是多數(shù)患者會(huì)

13、在內(nèi)分泌治療開始后2-3年內(nèi)轉(zhuǎn)變成去勢(shì)抵抗性前列腺癌(CRPC),此時(shí)則已有內(nèi)分泌治療手段即開始宣告失效。另一方面,目前化療藥物對(duì)前列腺癌效果均不理想,因而尋找新的抗前列腺癌藥物顯得十分必要。
　　 鈣調(diào)蛋白是一種生理功能調(diào)節(jié)劑,在細(xì)胞生長(zhǎng)增殖過程中起重要作用。在惡性增殖的細(xì)胞中,鈣調(diào)蛋白的含量和活性均高出正常細(xì)胞。鈣調(diào)蛋白可與雄激素受體直接結(jié)合,兩者在結(jié)構(gòu)和功能上密切相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),給予鈣調(diào)蛋白拮抗劑可顯著抑制雄激素受體陽(yáng)

14、性的前列腺癌細(xì)胞系的增殖及誘導(dǎo)凋亡,其作用效能類似抗雄激素藥物。但是,目前已有的鈣調(diào)蛋白拮抗劑,如W7、三氟拉嗪等藥物對(duì)人體不良反應(yīng)較大,難以廣泛應(yīng)用于臨床前列腺癌的治療。
　　 小檗胺是從我國(guó)中草藥小檗屬植物中提取的的一種雙芐基異喹啉類生物堿,被廣泛用于治療各種原因尤其是腫瘤放化療引起的白細(xì)胞減少癥已有數(shù)十年,安全有效、價(jià)格低廉是其突出的優(yōu)勢(shì)。而通過對(duì)小檗胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)該藥物亦屬鈣調(diào)蛋白拮抗劑。我們課題組以往的研究發(fā)

15、現(xiàn)小檗胺在體外可有效抑制前列腺癌細(xì)胞增殖,并可通過上調(diào)bax基因、下調(diào)survivin基因的表達(dá)誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡,并推測(cè)該藥物對(duì)不同前列腺癌細(xì)胞系的作用活性的差異可能與其鈣調(diào)蛋白含量有關(guān)。以此為基礎(chǔ),本研究以不同雄激素受體表達(dá)情況的細(xì)胞系為研究目標(biāo),進(jìn)一步探討小檗胺體外抗前列腺癌作用的機(jī)制,并對(duì)其體內(nèi)抗前列腺癌作用的效能進(jìn)行評(píng)估,以期為小檗胺應(yīng)用于前列腺癌的臨床藥物治療提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　 研究方法：
　　

16、 1.小檗胺抗前列腺癌作用機(jī)制的體外實(shí)驗(yàn)研究選擇雄激素依賴性且雄激素受體陽(yáng)性表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞系LNCAP、雄激素非依賴性但雄激素受體弱陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞系CWR22RV1以及雄激素非依賴性且雄激素受體陰性細(xì)胞系PC3進(jìn)行體外培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。MTT法檢測(cè)不同濃度小檗胺對(duì)此三種細(xì)胞系細(xì)胞活力的影響,計(jì)算增殖抑制率及IC50；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小檗胺對(duì)三種細(xì)胞系細(xì)胞周期的影響。Caspase-3/8/9活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定小檗胺對(duì)L

17、NCAP、PC3細(xì)胞相應(yīng)Caspase凋亡酶活性的影響,以推測(cè)其可能介導(dǎo)的凋亡通路。Western-blotting法檢測(cè)小檗胺對(duì)LNCAP、PC3細(xì)胞Fas蛋白、雄激素受體表達(dá)情況的影響。
　　 2.小檗胺對(duì)前列腺癌細(xì)胞體內(nèi)作用的研究實(shí)驗(yàn)4-6周齡雄性balb-c/nu-nu裸小鼠24只,飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中,分別于背部皮下接種相應(yīng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CWR22RV1細(xì)胞混懸液0.2毫升,細(xì)胞計(jì)數(shù)約107個(gè)。待前列腺癌細(xì)胞皮下移植成瘤后,

18、隨機(jī)分為小檗胺處理與對(duì)照組,處理組為按60mg/kg體重每日腹腔注射小檗胺溶液,對(duì)照組以等劑量生理鹽水注射,每周測(cè)量、計(jì)算移植瘤體積,描繪生長(zhǎng)曲線。處理4周后處死裸小鼠,切取移植瘤脫水、浸蠟,制作石蠟切片,以TUNEL法檢測(cè)凋亡情況,計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)；免疫組織化學(xué)法檢查PCNA表達(dá)情況以反映移植瘤細(xì)胞增殖情況。
　　 研究結(jié)果：
　　 小檗胺對(duì)LNCAP、CWR22RV1及PC3細(xì)胞均顯示出明顯的抑制增殖作用,抑制作

19、用以對(duì)LNCAP細(xì)胞最強(qiáng),而對(duì)PC3細(xì)胞作用最弱,且均呈明顯的劑量依賴性。LNCAP、CWR22RV1及PC3細(xì)胞的48小時(shí)IC50分別為為15.06μg/ml、31.49μg/ml及37.04μg/ml。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示小檗胺處理后LNCAP細(xì)胞G1期細(xì)胞顯著增多,而S期及G2期細(xì)胞減少,而CWR22RV1細(xì)胞及PC3細(xì)胞則均出現(xiàn)了S期阻滯,尤以PC3阻滯于S期的細(xì)胞比例為高。Caspase酶活性分析顯示小檗胺處理后LNCAP及PC

20、3細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的Caspase-3/8/9活性升高,尤其LNCAP細(xì)胞出現(xiàn)了顯著強(qiáng)于PC3細(xì)胞的Caspase-8的活性升高,提示經(jīng)小檗胺處理后,兩種細(xì)胞均存在內(nèi)源性凋亡通路激活,而LNCAP同時(shí)出現(xiàn)了比更為顯著的外源性凋亡通路的激活,這可能是LNCAP細(xì)胞對(duì)小檗胺更為敏感的原因。Western-blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)小檗胺處理后LNCAP細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)明顯升高,而PC3細(xì)胞未查見類似變化；同時(shí)LNCAP細(xì)胞在經(jīng)過40μg/

21、ml小檗胺處理48小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)雄激素受體水平出現(xiàn)明顯下降。
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)24只裸小鼠皮下接種CWR222RV1細(xì)胞均獲得成功,估算移植瘤體積達(dá)約100mm3后即隨機(jī)編入小檗胺處理組及對(duì)照組進(jìn)行藥物干預(yù)。結(jié)果顯示,小檗胺處理組移植瘤生長(zhǎng)速度顯著慢于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)期間裸小鼠無意外死亡,藥物干預(yù)結(jié)束后剖取移植瘤,稱重計(jì)算移植瘤抑制率達(dá)45.1％。TUNEL法檢測(cè)移植瘤細(xì)胞凋亡率,對(duì)照組平均為4.7%,小檗胺處理組則為21.2%；免疫組

22、織化學(xué)法檢測(cè)移植瘤PCNA表達(dá),對(duì)照組平均為78.8%,小檗胺處理組則為40.9%,組間均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 研究結(jié)論：
　　 本研究結(jié)果提示小檗胺在體外對(duì)多種前列腺癌細(xì)胞系均具有增殖抑制作用,且其活性與細(xì)胞表達(dá)雄激素受體情況一致。小檗胺處理使雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞周期阻滯于G1期,而雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯于S期。小檗胺對(duì)雄激素依賴性及非依賴性前列腺癌細(xì)胞均可激活內(nèi)源性凋亡通路,而在雄激素依賴