高效乙醇發(fā)酵重組釀酒酵母菌株的構(gòu)建及Sfi1p蛋白在生孢與核配過程中的功能研究.pdf

1、本論文包括兩部分內(nèi)容：第一部分涉及利用重組DNA技術(shù)、化學(xué)誘變及有性重組構(gòu)建釀酒酵母乙醇發(fā)酵高效菌株；第二部分研究釀酒酵母SPB新組分蛋白Sfi1p在生孢及核配過程中的作用。
　　 由于化石能源的日益枯竭以及人們環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，燃料乙醇生產(chǎn)越來越受到人們的重視。目前燃料乙醇的生產(chǎn)仍然主要通過釀酒酵母發(fā)酵淀粉或糖質(zhì)原料來實(shí)現(xiàn)。如何通過提高糖－醇轉(zhuǎn)化率來提高原料利用率、降低生產(chǎn)成本，是燃料乙醇生產(chǎn)中亟待解決的問題。本研究通過重組DN

2、A技術(shù)、化學(xué)誘變和有性重組相結(jié)合的方法改造釀酒酵母工業(yè)菌株，提高了菌株在濃醪發(fā)酵條件下的發(fā)酵性能。
　　 本研究首先考察了缺失兩個(gè)編碼甘油－3－磷酸脫氫酶的基因GPD1和GPD2，同時(shí)過量表達(dá)編碼依賴于NAD+的谷氨酸合酶的基因GLT1的釀酒酵母工業(yè)菌株S812的發(fā)酵特性。結(jié)果表明，該菌株在含2％葡萄糖的YPD培養(yǎng)基中發(fā)酵，乙醇產(chǎn)量與出發(fā)菌株相比增加17％。然而在20％葡萄糖濃度下該菌株由于不能合成起滲透平衡劑作用的甘油而表現(xiàn)為

3、生長(zhǎng)代謝緩慢。通過在發(fā)酵液中添加終濃度為30mM的甘油作為滲透壓平衡劑可以在一定程度上緩解高滲透壓對(duì)酵母細(xì)胞的脅迫作用，但細(xì)胞仍不能適應(yīng)工業(yè)培養(yǎng)基中高糖濃度造成的高滲透壓。
　　 為加快甘油向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，提高菌株對(duì)高滲脅迫的抗性，使菌株更快適應(yīng)濃醪發(fā)酵環(huán)境，本研究采用重組DNA技術(shù)在喪失甘油合成能力的重組釀酒酵母菌株S812中分別過量表達(dá)編碼甘油/H+同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因STL1，以及對(duì)甘油主動(dòng)吸收起間接作用的GUP1、GUP2基

4、因，構(gòu)建出重組菌株LE17U(STL1過量表達(dá))，LE18U(GUP1過量表達(dá))以及LE19U(GUP2過量表達(dá))。發(fā)酵結(jié)果表明，在30mM甘油存在的情況下，菌株LE17U在葡萄糖濃度20％的發(fā)酵液中的生長(zhǎng)、代謝和乙醇生產(chǎn)能力都較對(duì)照菌株S812U有明顯提高，其中乙醇產(chǎn)量提高3.4％。而菌株LE18U和LE19U的發(fā)酵特征與對(duì)照菌株S812U相比沒有明顯改善。但是將發(fā)酵液中葡萄糖濃度提高至30％，LE17U菌株的生長(zhǎng)、代謝及乙醇產(chǎn)量受到

5、明顯抑制。
　　 為了進(jìn)一步改善重組菌株濃醪發(fā)酵特性，本研究采用了一種全新的方法，在二倍體菌株LE17D中缺失編碼α交配因子受體的基因STE2，構(gòu)建出菌株LE17DS2。將菌株LE17DS2經(jīng)EMS誘變后通過有性重組實(shí)現(xiàn)基因組重排。由于STE2缺失，基因組重排后的單倍體細(xì)胞不能重新形成二倍體，極大的簡(jiǎn)化了篩選過程提高了篩選通量，從而篩選到單倍體菌株LS75。在30％葡萄糖濃度的濃醪發(fā)酵中發(fā)酵，菌株LS75比對(duì)照菌株LE17U的乙

6、醇產(chǎn)量提高了10.88％，發(fā)酵周期縮短了10 h，而且對(duì)乙醇及高滲透壓的抗性顯著增強(qiáng)。這些研究結(jié)果證明：本研究采用的策略是一利有效的釀酒酵母乙醇發(fā)酵菌株改造方法。
　　 紡錘體極體(Spindle pole body，SPB)作為酵母細(xì)胞的微管組織中心，它在細(xì)胞分裂及細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性的維持過程中起著極其重要的作用，是細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域熱門的研究課題。Sfi1p是新發(fā)現(xiàn)的釀酒酵母SPB蛋白組分，定位于半橋上并橫跨整個(gè)半橋，對(duì)該蛋白功能及

7、作用機(jī)制的探索，能夠?yàn)楦叩日婧思?xì)胞中同源蛋白的研究提供有用的指導(dǎo)。
　　 本論文利用sfi1溫度敏感突變菌株探索Sfi1p在釀酒酵母減數(shù)分裂孢子形成和核配事件中的作用。分別在28℃和23℃考察攜帶不同類型SFI1溫度敏感等位基因的菌株生孢情況。通過分析突變菌株的生孢效率和孢子組成情況，發(fā)現(xiàn)Sfi1p C端的溫度敏感突變菌株即使在非限制性溫度下，生孢效率也低于野生型菌株，并且在生孢過程中主要形成二分體孢子。通過對(duì)具有明顯生孢缺陷的

8、突變菌株的微管、前孢子膜以及細(xì)胞核進(jìn)行熒光顯微觀察，發(fā)現(xiàn)Sfi1p C端突變菌株在釀酒酵母生孢過程中減數(shù)分裂Ⅱ發(fā)生異常，SPB不能正常分離，只能產(chǎn)生兩個(gè)前孢子膜，從而產(chǎn)生大量的二分體孢子。這些結(jié)果首次證明Sfi1p C端在釀酒酵母的減數(shù)分裂過程中具有重要作用。
　　 通過在28℃和23℃下相應(yīng)溫度敏感型突變體的交配效率分析以及對(duì)交配過程中細(xì)胞核的熒光顯微觀察，發(fā)現(xiàn)部分sfi1溫度敏感突變株在非限制性溫度下表現(xiàn)出明顯的雜交效率降低