頭孢曲松鈉減輕水通道蛋白4抗體對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的毒性作用.pdf

1、目的:視神經(jīng)脊髓炎(Neuromyelitis optica，NMO)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性炎性脫髓鞘性疾病，主要累及視神經(jīng)和脊髓。自從發(fā)現(xiàn)NMO患者血清中存在特異性抗體即水通道蛋白(Aquaporin-4，AQP4)抗體以來，越來越多的證據(jù)表明其在NMO發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。AQP4抗體和星形膠質(zhì)細(xì)胞突觸表面的AQP4結(jié)合能引起補(bǔ)體依賴性和抗體依賴性細(xì)胞毒性作用導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞的死亡、炎癥細(xì)胞募集、細(xì)胞因子釋放和血腦屏障的破壞

2、，產(chǎn)生NMO病理改變。近年研究提示谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1（glial glutamate transporter-1，GLT-1）和谷氨酸興奮性毒性作用可能涉及NMO發(fā)病機(jī)制，但結(jié)論不一。眾所周知頭孢曲松鈉能上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞的GLT-1表達(dá)，故本研究使用體外原代培養(yǎng)的新生SD大鼠(Sprague-Dawleyrats)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞，觀察頭孢曲松鈉對(duì)AQP4抗體陽性血清誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞毒性作用、GLT-1表達(dá)以及谷氨酸濃度的影響，探討頭孢曲

3、松鈉是否能減輕AQP4抗體對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的毒性作用。
　　方法:常規(guī)方法提取出生后24h之內(nèi)的SD大鼠的大腦皮層。將皮層神經(jīng)細(xì)胞接種于直徑為35mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液為含20％胎牛血清的DMEM/F12，在37℃CO2孵育箱中培養(yǎng)，分別在24h、72h、6d后更換培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)共分為4組:1.對(duì)照組:10％的比例加入健康人血清;2.AQP4抗體陽性組:10％的比例加入AQP4抗體陽性NMO患者血清;3.頭孢曲松鈉預(yù)處理組:給予AQP4

4、抗體陽性血清干預(yù)前10uM濃度頭孢曲松鈉干預(yù)48h;4.頭孢曲松鈉組:給予10uM濃度頭孢曲松干預(yù)48h后正常培養(yǎng)24h。細(xì)胞培養(yǎng)9d后進(jìn)行免疫組織化學(xué)熒光染色。觀察不同實(shí)驗(yàn)組星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和數(shù)目的變化;同時(shí)使用比色法測(cè)定上清液谷氨酸濃度，使用免疫印跡分析GLT-1表達(dá)水平。結(jié)果采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，所有計(jì)量資料采用(x)±s表示，多組間單因素方差分析。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1 A

5、QP4抗體及頭孢曲松鈉對(duì)原代培養(yǎng)的大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目的影響:
　　熒光顯微鏡下觀察，對(duì)照組星形膠質(zhì)細(xì)胞外形清晰，突起粗壯;AQP4抗體陽性組星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體腫脹、突起斷裂甚至消失，而頭孢曲松鈉預(yù)處理組星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化明顯減輕。對(duì)照組、AQP4抗體陽性組和頭孢曲松鈉預(yù)處理組星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目分別為117.60±12.42個(gè)/視野、15.20±3.83個(gè)/視野和69.40±9.18個(gè)/視野，各組間比較差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

6、F值93.02 P均＜0.01）。而頭孢曲松鈉組并不引起星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目（112.80±15.29個(gè)/視野）與對(duì)照組相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2 AQP4抗體及頭孢曲松鈉對(duì)原代培養(yǎng)的大鼠皮層細(xì)胞上清液中谷氨酸濃度的影響:
　　使用比色法測(cè)定不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的谷氨酸濃度，研究發(fā)現(xiàn)AQP4抗體陽性組谷氨酸濃度(1356.30±330.95μM)較對(duì)照組(742.02±136.0

7、4μM)明顯升高(P＜0.01);頭孢曲松鈉預(yù)處理組谷氨酸濃度(676.89±176.90μM)與AQP4抗體陽性組比較有明顯下降(P＜0.01);頭孢曲松鈉組谷氨酸濃度（740.76±174.63μM）與對(duì)照組及頭孢曲松鈉預(yù)處理組比較差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。
　　3 AQP4抗體及頭孢曲松鈉對(duì)原代培養(yǎng)的大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞表面GLT-1表達(dá)的影響:
　　使用免疫印跡法分析AQP4抗體以及頭孢曲松鈉預(yù)處理對(duì)GL

8、T-1的表達(dá)的影響。研究顯示和對(duì)照組(0.69±0.16)比較，頭孢曲松鈉能明顯增加GLT-1表達(dá)（1.02±0.30，P＜0.01）;AQP4抗體陽性組GLT-1表達(dá)水平(0.52±0.15)較對(duì)照組明顯減少(P＜0.05);頭孢曲松鈉預(yù)處理組GLT-1表達(dá)水平(0.82±0.23)與AQP4抗體陽性組比較有明顯上調(diào)(P＜0.01);而頭孢曲松鈉預(yù)處理組與對(duì)照組比較差別無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1