含‘防御性’信號肽的三類樹蛙活性肽的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、兩棲動物皮膚中含有豐富的活性多肽，被稱為天然活性多肽的分子資源庫，是人類研究和開發(fā)藥用活性肽的一個重要源泉。
　　以廣西棱皮樹蛙（Thelodermakwangsiensis）和屏邊泛樹蛙（Polypedatespingbianenisis）為研究對象，采用超濾管離心、反向高效液相色譜、活性跟蹤等手段，得到了三條活性多肽，應(yīng)用Edman降解法、質(zhì)譜以及基因克隆等手段確定它們的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列，通過與兩棲皮膚同類活性肽的

2、氨基酸序列比較，將這三條活性多肽分別命名為:pleurain-al-thel、tachykinin-Thel和polypedatein。比較三條多肽與其它活性多肽的前體序列，它們都具有使兩棲動物逃避被捕食或抗微生物感染的防御性功能，信號肽部分相似度較高，將這幾類活性性多肽統(tǒng)稱為防御性多肽，它們保守的信號肽部分建議為‘防御性’信號肽。最后，對這三條活性多肽分別進(jìn)行了生物學(xué)活性分析，構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。
　　從廣西棱皮樹蛙皮膚分泌液分離

3、到抗菌肽pleurain-al-thel，其氨基酸序列是RILTMTKRVKMPQLYKQIVCRLFKTC，由26個氨基酸殘基組成，分子量為3194.796Da，預(yù)測等電點(diǎn)(pI)是10.57。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)pleurain-al-thel與蛙科來源的抗菌肽pleurain-al具有非常高的序列相似性，屬于pleurain-al家族，表明蛙科和樹蛙科都有共同的抗菌肽家族。抑菌活性檢測發(fā)現(xiàn)，Pleurain-al-thel對白色念珠菌C.

4、albicansATCC2002的抑菌活性較強(qiáng)，MIC值為10μg/ml，對其它已經(jīng)測試的微生物抑菌活性較弱。Pleurain-al-thel幾乎沒有溶血活性，在濃度為100和200μg/ml時對人紅細(xì)胞的溶血活性分別為2.5％和3.7％，對兔紅細(xì)胞的溶血活性分別為3.2％和3.5％。此外，我們還對pleurain-al-thel多肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了CD和NMR分析，發(fā)現(xiàn)pleurain-al-thel在MeOH/H2O溶液以及SDS溶液中

5、主要以α-helix為主，原因可能是兩棲類皮膚抗菌肽是誘導(dǎo)表達(dá)型，MeOH/H2O溶液以及SDS溶液是一種擬膜溶液，在擬膜溶液中抗菌肽具有兩親性構(gòu)象，有利于pleurain-al-thel與細(xì)菌質(zhì)膜的相互作用，為其殺菌活性提供物質(zhì)基礎(chǔ)。核酸系統(tǒng)發(fā)育樹上，pleurain-al-thel與pleurain-al在同一分支上。
　　從廣西棱皮樹蛙皮膚分泌液分離出速激肽tachykinin-Thel，其氨基酸序列是KPSPDRFYGLM

6、，由11個氨基酸殘基組成，分子量是1309.6Da，預(yù)測等電點(diǎn)(pI)是8.59。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)tachykinin-Thel是一個典型的速激肽樣多肽，其C端含有速激肽類多肽保守性的結(jié)構(gòu)F(Y/I)GLM-NH2。Tachykinin-Thel與雨蛙來源的tachykininH1具有80％的序列相似性，結(jié)構(gòu)上的高相似性可能與它們的生存環(huán)境相似有關(guān)。Tachykinin-Thel可以誘導(dǎo)豚鼠回腸肌收縮，在16nM濃度下收縮達(dá)到最大，氨基酸發(fā)

7、育樹上Tachykinin-Thel與雨蛙科來源的速激肽tachykininH1在同一小分支上。
　　從屏邊泛樹蛙皮膚分泌液得到polypedatein，其氨基酸序列是TLLCKYFAIC，由10個氨基酸殘基組成，分子量是1173.59Da，預(yù)測等電點(diǎn)(pI)是7.74。Polypedatein與目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的任何兩棲動物來源的活性多肽的成熟肽部分沒有相同的保守性結(jié)構(gòu)，表明其屬于一個新的兩棲類親肌肽家族，與兩棲類皮膚其它親肌肽結(jié)構(gòu)

8、比較，它們的信號肽具有高度的序列相似性。Polypedatein能夠誘導(dǎo)大鼠回腸肌收縮，EC50為10μM，不具有抗菌和蛋白酶抑制劑等活性。核酸發(fā)育樹上與polypedatein關(guān)系最近的是來源于無指盤臭蛙皮膚分泌液的tachykinin-O。
　　通過對三條多肽前體序列的比較分析，它們與兩棲類皮膚其它類活性多肽在信號肽部分具有很高的相似性，而兩棲類皮膚活性肽如抗菌肽讓兩棲動物免受病原微生物的感染，緩激肽、速激肽因為具有致痛和誘導(dǎo)