兩種防御性多肽的分離純化、結(jié)構(gòu)、功能及作用機(jī)制研究.pdf

1、生物防御性物質(zhì)主要具有防御的功能，如抵抗捕食者或寄主侵襲、微生物感染或保護(hù)自己不受到環(huán)境因子的損傷以及在受到傷害時減輕自己的痛苦和盡快恢復(fù)到正常狀態(tài)。抗感染和鎮(zhèn)痛是兩類最常見的防御機(jī)制，與此相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)是抗感染因子和鎮(zhèn)痛因子，如抗菌肽和鎮(zhèn)痛肽。
　　抗菌肽是一種防御性的多肽，在抵御細(xì)菌、病毒和真菌侵襲中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。防御素是抗菌肽中研究最多最廣的一類陽離子抗菌肽家族。迄今為止，有300多條防御素被發(fā)掘和鑒定出來。防御素廣

2、泛地存在于動物、植物和真菌中，為生物體提供免疫防護(hù)。
　　本論文以福鼎蠑螈(Cynopsfudingensis)為研究對象，對其皮膚中的抗微生物多肽進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)功能研究。本研究運(yùn)用活性追蹤與分離純化相結(jié)合的方法。依據(jù)分子量大小，通過Sephadex G-50凝膠過濾層析對福鼎蠑螈皮膚分泌物中的活性物質(zhì)進(jìn)行初步分離，隨后運(yùn)用反相高效液相色譜將Sephadex G-50分離后的活性峰進(jìn)一步分離純化。從福鼎蠑螈皮膚分泌物中分離純化

3、獲得了一種新抗菌肽CFBD-1，并從福鼎蠑螈cDNA文庫中克隆出編碼CFBD-1成熟肽的完整cDNA序列。CFBD-1前體肽是由17個氨基酸殘基的信號肽，41個氨基酸殘基的成熟肽和3個氨基酸殘基的中間肽構(gòu)成。成熟肽中有6個半胱氨酸，可形成三對二硫鍵。序列相似度分析發(fā)現(xiàn)CFBD-1中的六個半胱氨酸具有高度保守性，與脊椎動物的β-防御素序列非常類似，是β-防御素家族的新成員。這也是首次從有尾類兩棲動物中發(fā)現(xiàn)防御素抗菌肽。為便于后續(xù)研究，我們

4、構(gòu)建了CFBD-1原核表達(dá)體系，將編碼CFBD-1成熟肽的基因克隆到PET表達(dá)載體中，進(jìn)行轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)表達(dá)，獲得具有His-tag的融合蛋白產(chǎn)物。通過親和層析對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，經(jīng)甲酸化學(xué)裂解，SephadexG-50和RP-HPLC分離純化獲得與天然純化多肽活性一致的目的多肽?？咕钚詸z測表明CFBD-1具有廣譜的抑菌效果，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和白色念球菌都有抑制活性。其中對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抑菌效果較強(qiáng)，其

5、最小抑菌濃度(MIC)值為65μg/ml;對革蘭氏陰性菌的抑菌活性較弱，對枯草芽孢桿菌的MIC值為135μg/ml;對大腸桿菌的MIC值為160μg/ml;對真菌白色念球菌的MIC值為200μg/ml。
　　本文中我們還對另外一類防御性多肽（蜘蛛鎮(zhèn)痛肽）進(jìn)行了研究。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的蜘蛛毒素多肽中，有很大一部分毒素都作用于電壓門控離子通道，其中約有三分之一的毒素都作用于鈉通道。蜘蛛毒素中的半胱氨酸的分布非常保守，多數(shù)蜘蛛毒素半胱氨酸的配對

6、方式為C1-C4，C2-C5和C3-C6，形成典型的抑制劑半胱氨酸結(jié)膜體(ICK)結(jié)構(gòu)。泰國金屬藍(lán)蜘蛛（Haplopelma lividum）是一種典型的穴居蜘蛛，成年蜘蛛足展長130～150mm，生活在泰國和緬甸的熱帶雨林中，以蟋蟀、蝸牛等昆蟲和小動物為食。泰國金屬藍(lán)蜘蛛行動迅速，具有較強(qiáng)毒性，被泰國金屬藍(lán)蜘蛛蜇咬后會產(chǎn)生劇烈的疼痛，暗示著該蜘蛛毒液中可能存在神經(jīng)毒素。我們通過研究泰國金屬藍(lán)蜘蛛毒腺的轉(zhuǎn)錄組，篩選得到一種含有4對二硫鍵

7、、由39個氨基酸組成的新型多肽毒素(μ-TRTX-Hl1a)，該多肽毒素形成保守的ICK結(jié)構(gòu)。本研究通過化學(xué)合成和氧化還原復(fù)性得到μ-TRTX-Hl1a多肽毒素。我們采用膜片鉗技術(shù)在大鼠背跟神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上研究μ-TRTX-Hl1a對離子通道的可能活性，發(fā)現(xiàn)μ-TRTX-Hl1a對電壓門控鉀通道、鈣通道及河豚毒素敏感型的鈉離子通道(TTX-S)均沒有作用，但能夠選擇性的抑制河豚毒素不敏感型鈉離子通道(TTX-R)的電流。μ-TRTX-Hl1

8、a對DRGTTX-R型鈉通道電流的抑制具有濃度依賴性，其半數(shù)有效抑制濃度(IC50)為3.76±0.21μM。鈉離子通道各亞型質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，并檢測μ-TRTX-Hl1a對這些鈉通道亞型的選擇性，發(fā)現(xiàn)該毒素能選擇性抑制Nav1.8電流而對其它亞型沒有作用。μ-TRTX-Hl1a作用于Nav1.8的IC50為2.19±0.18μM。μ-TRTX-Hl1a對Nav1.8離子通道的電壓電流曲線、電導(dǎo)電壓曲線沒有影響，也不改變

9、通道穩(wěn)態(tài)失活。四種鎮(zhèn)痛模型（福爾馬林誘導(dǎo)的舔足模型、輻射熱導(dǎo)致的甩尾模型、冰醋酸誘導(dǎo)的扭體模型、熱板模型）被應(yīng)用于研究μ-TRTX-Hl1a的鎮(zhèn)痛活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)μ-TRTX-Hl1a能夠降低冰醋酸引起的小鼠扭體反應(yīng);能顯著延長小鼠在甩尾和熱板模型中對熱痛的反應(yīng)時間;能顯著地減少福爾馬林在Ⅰ相和Ⅱ相時期誘導(dǎo)的舔足次數(shù)。這表明μ-TRTX-Hl1a能顯著地抑制神經(jīng)痛和炎癥痛，并對熱痛也有抑制作用，其具有廣泛的鎮(zhèn)痛效果。
　　CFBD-