以膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為靶點的藥物篩選模型的構(gòu)建與應(yīng)用研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是缺血性心腦血管疾病(如冠心病、心絞痛、心肌梗塞、腦卒中等)共同的病理生理基礎(chǔ)，而外周細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝障礙是動脈粥樣硬化的重要發(fā)病機(jī)制。過量膽固醇從肝外組織中的清除是預(yù)防和治療AS的關(guān)鍵步驟。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP-binding cassette transporter A1 ABCA1)是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族成員之一，是一種重要的以ATP為能源轉(zhuǎn)運(yùn)各種離子、脂類等細(xì)胞

2、代謝物的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。ABCA1可介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)磷脂和游離膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至貧脂或無脂的載脂蛋白A-I( apolipoprotein A-I, apoA-I)，從而促進(jìn)高密度脂蛋白(highdensity lipoprotein, HDL)生成。此過程被譽(yù)為脂質(zhì)外流的限速步驟，在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，ApoA- I與ABCA1是類似于一種受體一配體的相互作用來發(fā)揮其功能的。據(jù)此原理，我們建立了基于與ABCA1結(jié)合的ApoA-

3、I的cell-ELISA-like的高通量篩選模型，對本實驗室的合成和天然產(chǎn)物化合物庫進(jìn)行大規(guī)模篩選，以其發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)ABCA1活性的化合物，為治療抗動脈粥樣硬化的新型先導(dǎo)化合物的出現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。本研究采用trizol法提取MRC-5細(xì)胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成。DNA。以此cDNA為模板，采用高保真的Prime Star DNA聚合酶和分段PCR的策略，進(jìn)行限制性內(nèi)切酶分析后，我們從其內(nèi)部選擇了xho I、EcoR I、Nhe I三個酶切位點

4、，ABCA1 cDNA兩端分別添加了sac I和sal I酶切位點，分段克隆了1823bp1061 bp,2750 by和1664by的片段，與pMD-19T simple載體連接并測序正確后，酶切后與真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP載體連接構(gòu)建成功ABCA1( cDNA全長6789bp)的真核表達(dá)載體。將構(gòu)建成功的載體轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞，以6418 SOOg/ml的濃度篩選出穩(wěn)定表達(dá)ABCA1的單克隆細(xì)胞，以此單克隆細(xì)胞包被％孔板，加入

5、8g/ml ApoA- I為配基，孵育2小時后，依次加入anti-ApoA- I一抗和相應(yīng)二抗，TMB顯色，450nm測定OD值。經(jīng)各項條件優(yōu)化后，建立起以ABCA1為靶標(biāo)的。ell-ELISA-like高通量篩選模型，以ABC家族抑制劑格列本脈為陽性藥對模型進(jìn)行評價，接著對本室2600個天然和合成化合物庫進(jìn)行了篩選，從中發(fā)現(xiàn)了一種氧雜蔥酮(口山酮)類化合物No2026791具有明顯的上調(diào)ABCA1活性的作用，其在SOM時上調(diào)活性達(dá)30

6、％。流式細(xì)胞術(shù)和western-blot分析均證實了N2026791增加了細(xì)胞表面ApoA- I的結(jié)合，證實Ns2026791可能為上調(diào)ABCA1介導(dǎo)的脂質(zhì)外流活性的激動劑。本研究建立的ABCA1為靶標(biāo)的cell-ELISA-like高通量新藥篩選模型，可用來篩選對ABCA1脂質(zhì)外流活性起調(diào)節(jié)作用的合成化合物及天然產(chǎn)物提取物，具有一定的創(chuàng)新性和廣泛的實用性。篩選得到的陽性化合物Ns2026791經(jīng)多種方法證實，具有潛在提高ABCA1脂質(zhì)