以Vif降解hA3G為靶點的抗HIV-1藥物篩選模型應(yīng)用.pdf

1、APOBEC3G(hA3G)是在人的淋巴細(xì)胞中表達(dá)的一種RNA/DNA編輯酶，可以高效抑制HIV—1的復(fù)制，因此成為宿主細(xì)胞固有的HIV—1病毒限制因子。HIV—1病毒編碼的Vif蛋白(viral infectivity factor)可以特異性地結(jié)合hA3G，通過泛素介導(dǎo)的降解途徑[3]，導(dǎo)致hA3G的降解，從而阻斷了宿主細(xì)胞hA3G對HIV—1病毒復(fù)制的抑制作用。鑒于HIV—1主要的靶細(xì)胞均表達(dá)hA3G，阻斷Vif介導(dǎo)的hA3G的降

2、解途徑成為一個極具潛力的抗HIV—1病毒的新靶點。
　　 本研究建立和優(yōu)化了以Vif對hA3G的降解作用為靶點，生物熒光為檢測手段的抗HIV—1藥物篩選模型。通過酶標(biāo)儀檢測、Western blot等分析方法發(fā)現(xiàn)陽性化合物MG312可以顯著上調(diào)細(xì)胞中熒光水平及融合蛋白hA3G—YFP表達(dá)水平，驗證了該模型可以用來篩選阻斷Vif對hA3G降解作用的活性化合物。同時，根據(jù)腺病毒E4orf6降解P53的機制建立了一個用來排除蛋白酶體降

3、解通路阻斷劑的復(fù)篩模型。
　　 隨后本上作應(yīng)用該初篩模型從化合物庫、微生物次級代謝產(chǎn)物庫篩選可以阻斷Vif降解hA3G的活性物質(zhì)。對本所重點室化合物庫中的3100個化合物的初篩中，得到8個陽性化合物。同時完成對微生物次級代謝產(chǎn)物庫中7300個發(fā)酵液的樣品的篩選，獲得64株剛性菌株，其中有8株有非常好的抗病毒活性。根據(jù)這些陽性菌株發(fā)酵液穩(wěn)定性、模型活性、抗病毒活性以及活性的可重復(fù)性，選擇I06A—02348作為陽性發(fā)酵菌株，對其發(fā)

4、酵產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行探索性的分離純化，以期得到有臨床應(yīng)用前景的新的化合物。目前已從此發(fā)酵液中得到一些組分，在Vif—hA3G細(xì)胞篩選模型上顯出很好的活性。
　　 為進(jìn)一步優(yōu)化藥物篩選模型，本課題應(yīng)用了IRES(Internal ribosome entry site)艤蛋白表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建了同時表達(dá)Vif和融合蛋白hA3G—YFP的真核表達(dá)載體，建立了穩(wěn)定表達(dá)雙蛋白的細(xì)胞系，以取代現(xiàn)行的瞬時表達(dá)篩選模型。目前該質(zhì)粒已經(jīng)構(gòu)建成功