BDNF誘導線粒體在突觸前的定位并增強其引起的突觸傳遞作用.pdf

1、研究背景:
　　線粒體作為一種極其重要的細胞器，參與了細胞內的ATP生成，鈣離子濃度的維持以及細胞凋亡等過程。而在神經(jīng)元中，將線粒體準確運輸?shù)酵挥|部位，對于調控突觸前的遞質釋放，突觸后的離子轉運以及樹突棘的形成都有重要的意義。
　　前人對線粒體運動機制的研究發(fā)現(xiàn)，驅動蛋白Kinesin家族成員KIF5A/B/C，KIF1Bα和KLP6等，參與了線粒體沿著軸突的順向運輸。而除了對相關驅動蛋白的研究外，對于調控線粒體運動的細胞內

2、信號分子的報道也有很多，例如，NGF可以通過激活下游的PI3K從而調控線粒體運輸;五羥色胺和多巴胺可以激活Akt-GSK3β信號通路影響線粒體運輸;鈣離子也可以作為一種第二信使調控線粒體運輸。最近的研究發(fā)現(xiàn)，KIF5，Milton和Miro1可以組成復合體介導線粒體沿著微管的運輸，而在這個復合體中Miro1起了鈣離子感受器的作用。
　　腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)作為一種廣泛表達在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在調控神經(jīng)元的生長

3、、發(fā)育以及突觸的可塑性中發(fā)揮著重要作用。BDNF的功能由兩個受體介導，TrkB受體和P75受體，下游還有MAPK、PI3K和PLCγ等分子來傳遞細胞內信號。據(jù)報道，BDNF可以調控腦內的線粒體代謝，從而調控ATP的生成。但是，BDNF是通過何種機制來調控線粒體的運輸從而影響其功能的，卻仍然不清楚。
　　本實驗利用活細胞成像技術以及線粒體分離技術，研究BDNF對于線粒體運動的影響，并進一步探討線粒體的運動在BDNF的生物學功能中的所

4、起的作用，研究結果如下:
　　1.BDNF刺激神經(jīng)元使突起中運動線粒體比例減少
　　我們運用活細胞成像技術和脂質體轉染技術觀察線粒體運動情況。發(fā)現(xiàn)BDNF短時間（15分鐘）處理神經(jīng)元，可以顯著減少順軸突和逆軸突運動的線粒體的比例。為了檢測BDNF對于線粒體運動影響的特異性，我們又用GFP標記的Rab5來顯示內體，發(fā)現(xiàn)內體的運動不受BDNF調控，說明BDNF特異性的影響線粒體的運動。有研究表明，BDNF可以增加線粒體的氧化磷酸

5、化以及ATP的生成。但我們發(fā)現(xiàn)短時間的BDNF處理沒有影響線粒體的膜電位以及ATP的生成。說明線粒體的運動狀態(tài)改變是在功能改變之前發(fā)生的。
　　2.BDNF引起的運動中線粒體比例降低需要激活PI3K和PLCγ
　　由于發(fā)現(xiàn)了BDNF促進神經(jīng)元中線粒體運動停止這一現(xiàn)象，后續(xù)實驗旨在研究這一現(xiàn)象的具體機制。我們通過使用激酶抑制劑阻斷信號通路，發(fā)現(xiàn)BDNF引發(fā)的線粒體運動停止依賴于TrkB-PI3K和TrkB-PLCγ-IP3R信

6、號通路。
　　3.細胞內鈣離子的上調是BDNF引發(fā)線粒體運動停止的必要條件
　　前面發(fā)現(xiàn)的兩條信號通路都可以調控BDNF引起的鈣離子濃度變化，而鈣離子是線粒體運動重要的調節(jié)因子。因此我們使用了胞內鈣離子螯合劑BAPTA-AM和胞外鈣離子螯合劑EGTA，發(fā)現(xiàn)都可以阻礙BDNF引發(fā)的線粒體運動停止。
　　研究發(fā)現(xiàn)，TRPC通道對鈣離子有透過性并且可以被BDNF激活，因此我們使用TRPC通道抑制劑SKF-96365，并檢測線

7、粒體運動，發(fā)現(xiàn)BDNF對于線粒體運動的調控被完全阻斷了。說明TRPC介導了BDNF引起的線粒體運動停止。
　　4.Miro1參與調節(jié)BDNF誘導的線粒體運動停止
　　上述研究闡明了鈣離子調控了線粒體的運動停止，接下來我們探討鈣離子通過何種途徑來實現(xiàn)這個過程。有研究表明線粒體外膜蛋白Miro1可作為鈣離子濃度感受器調節(jié)線粒體的運動。我們通過基因突變的方式，將野生型或突變型Miro1（突變蛋白命名為Miro1KK，其EF結構域發(fā)

8、生突變從而失去鈣離子結合能力）轉染進海馬神經(jīng)元中，檢測線粒體運動，發(fā)現(xiàn)在表達Miro1 KK的神經(jīng)元中，BDNF無法引起線粒體運動停止。上述結果表明Miro1可能通過與鈣離子結合介導了BDNF引發(fā)的線粒體運動停止。
　　5.BDNF引起的線粒體運動停止有利于BDNF促進突觸傳遞
　　由于線粒體能夠為神經(jīng)元的正常功能，特別是突觸可塑性，提供能量和調控鈣離子濃度。接下來我們要檢測BDNF引發(fā)的線粒體運動停止是否促進線粒體在突觸處

9、的聚集。通過免疫熒光共定位實驗，發(fā)現(xiàn)BDNF處理的神經(jīng)元中，線粒體與SV2共定位顯著增加，并且受到Mir01KK突變體影響。
　　我們用FM1-43熒光染色檢測BDNF增強囊泡釋放的過程。實驗結果表明BDNF確實可以促進軸突末梢囊泡的釋放，而這一增強作用在Miro1KK突變體轉染的神經(jīng)元中受到了抑制，這表明線粒體在突觸部位的聚集參與BDNF調控的神經(jīng)遞質釋放。
　　結論:
　　1.BDNF處理神經(jīng)元使突起中運動線粒體比