線粒體相關(guān)蛋白調(diào)控突觸核蛋白病理學(xué)作用研究.pdf

1、PINK1是一種線粒體絲氨酸/蘇氨酸激酶，保護細(xì)胞壓力應(yīng)激所導(dǎo)致的線粒體功能障礙，調(diào)控神經(jīng)元分化。突變的PINK1(PARK6)導(dǎo)致常染色體隱性遺傳早發(fā)性帕金森病(PD)。β-synuclein(β-syn)是α-syn同系物，其錯義突變β-syn P123H被發(fā)現(xiàn)存在于家族性路易體癡呆患者。突變蛋白β-syn P123H在細(xì)胞內(nèi)形成嗜酸性包涵體，并且與LAMP-2，ATP13A2，cathepsin等溶酶體標(biāo)志物共存，在胞漿聚集誘導(dǎo)細(xì)

2、胞凋亡，具有加速神經(jīng)退化的毒性作用。PINK1能夠維持線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，在PD病理學(xué)變化過程起著關(guān)鍵作用，但是 PINK1通過線粒體保護作用介導(dǎo)突觸核蛋白病理學(xué)過程的機制還不清楚。本課題將在穩(wěn)定表達(dá)Parkin的HeLa細(xì)胞及穩(wěn)定表達(dá)β-syn P123H的B103神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞進(jìn)行，研究PINK1/Parkin通過調(diào)控線粒體自噬，促進(jìn)β-syn P123H自噬降解的神經(jīng)保護作用及其分子機制。
　　本文采用PCR構(gòu)建PINK1野生型

3、(PINK1 WT)及兩步PCR法定點突變技術(shù)構(gòu)建PINK1 Q126P、E240K、G309D、L347P、P498L突變真核表達(dá)載體，測序驗證后應(yīng)用免疫印跡技術(shù)(Western Blot)鑒定其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況。WST-1細(xì)胞活性檢測及LDH細(xì)胞毒性實驗分析PINK1 WT及突變體對細(xì)胞存活的影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染PINK1突變體的細(xì)胞存活率下降，細(xì)胞毒性增加。相比對照組，轉(zhuǎn)染野生型 PINK1質(zhì)粒的細(xì)胞無顯著性差異。應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光

4、化學(xué)染色的方法，觀察PINK1 WT及其突變體細(xì)胞定位情況，以及Parkin突變體T240R、R275W的細(xì)胞分布形態(tài)。運用線粒體TMRE熒光標(biāo)記技術(shù)，以FCCP組作為陽性對照，分析Parkin突變體T240R、R275W對線粒體膜電位的影響。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及Western Blot方法，分析PINK1、Parkin對線粒體分裂融合動態(tài)變化的影響。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：PINK1突變后線粒體異常聚集。Parkin突變體在胞漿形成聚集

5、體，并且導(dǎo)致線粒體膜電位降低。免疫印跡分析結(jié)果顯示：PINK1、Parkin的突變則導(dǎo)致了線粒體分裂、融合功能降低。野生型PINK1、Parkin參與線粒體質(zhì)量控制，促進(jìn)β-synP123H自噬降解。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)實驗證明β-synP123H及ParkinT240R聚集體經(jīng)自噬溶酶體途徑降解，ParkinT240R則加重了β-synP123H聚集體的形成。通過自噬誘導(dǎo)劑Rapamycin，抑制劑3-MA、NH4Cl作用，結(jié)合TUNEL

6、細(xì)胞凋亡檢測方法，研究自噬在β-synP123H、ParkinT240R所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程的作用。對TUNEL陽性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示：相對于DMSO組，3-MA、NH4Cl組細(xì)胞死亡數(shù)目明顯增多，而Rapamycin組細(xì)胞死亡數(shù)目減少?？傊?，突變PINK1誘導(dǎo)線粒體斷裂形成聚集體，并且導(dǎo)致細(xì)胞活性下降，細(xì)胞毒性增加。Parkin突變體在細(xì)胞內(nèi)形成聚集體，導(dǎo)致線粒體膜電位降低。Parkin突變聚集體和β-synP123H經(jīng)自