鐵和細胞外α-突觸核蛋白影響體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞的作用研究.pdf

1、帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是一種以黑質(zhì)致密帶多巴胺（dopamine, DA）能神經(jīng)元進行性缺失為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。其臨床表現(xiàn)為運動不能、肌僵直、靜止性震顫及姿勢反射障礙等。盡管研究顯示遺傳、環(huán)境和年齡等因素均可能參與PD發(fā)病，但其確切病因不清。PD的主要病理特征是黑質(zhì)（substantia nigra, SN）致密部多巴胺能神經(jīng)元缺失和路易小體（Lewy body, LB）的形成。α-突觸核

2、蛋白是LB的主要成分，神經(jīng)元中α-突觸核蛋白的異常聚集能夠改變細胞膜電位、損傷線粒體功能、誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum, ER）應(yīng)激而造成細胞損傷，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是α-突觸核蛋白的核心毒性作用機制之一。除了長期以來關(guān)注的其在細胞內(nèi)的毒性作用之外，α-突觸核蛋白能夠被神經(jīng)元釋放，進而被周圍的細胞（包括神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞等）再攝取，從而能夠在細胞-細胞之間、相互聯(lián)系的結(jié)構(gòu)之間進行傳遞。鐵沉積是PD另一重要的神經(jīng)病理學(xué)

3、改變，尸檢證據(jù)表明，PD黑質(zhì)區(qū)單個神經(jīng)元內(nèi)的鐵含量增高，黑質(zhì)鐵的水平與PD的進程相關(guān)。本課題組前期研究證實鐵能夠促進α-突觸核蛋白的聚集，增強α-突觸核蛋白在細胞內(nèi)的毒性作用，然而鐵沉積與細胞間傳播的α-突觸核蛋白之間的關(guān)系尚未有研究報道。
　　以往神經(jīng)退行性疾病的研究熱點都集中在特定受損的神經(jīng)元上，占腦體積20%-50%的星形膠質(zhì)細胞在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、突觸傳遞、離子平衡、神經(jīng)免疫等方面，都起著十分重要的作用，因此星形膠質(zhì)細胞在神

4、經(jīng)退行性疾病的作用開始受到關(guān)注。星形膠質(zhì)細胞本身表達極低水平的α-突觸核蛋白，但其能攝取胞外的α-突觸核蛋白。進入到星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的α-突觸核蛋白的聚集促進促炎因子和化學(xué)因子的釋放，進而導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷和小膠質(zhì)細胞的繼發(fā)性激活。本研究選用C6膠質(zhì)瘤細胞（星形膠質(zhì)細胞瘤的細胞系），原代培養(yǎng)的腹側(cè)中腦（ventral mesencephalon，VM）星形膠質(zhì)細胞及VM神經(jīng)元為細胞模型，應(yīng)用蛋白免疫印跡、免疫熒光、熒光實時定量PCR、流式細

5、胞術(shù)等方法，深入探討細胞外的α-突觸核蛋白處理后VM星形膠質(zhì)細胞促炎因子的變化及鐵對此過程的影響，并評價內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否參與了細胞外α-突觸核蛋白的毒性作用，并觀察VM神經(jīng)元的損傷變化。研究結(jié)果如下：
　　1.100 nmol/L、300 nmol/L的α-突觸核蛋白單體處理C6膠質(zhì)瘤細胞24 h后，IL-1βmRNA的升高分別約為對照組的1.83、2.69倍，TNF-αmRNA的升高分別約為對照組的1.35、1.74倍，與對照組相

6、比差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；且100 nmol/L組與300 nmol/L組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。以上結(jié)果說明，α-突觸核蛋白單體能夠引起C6膠質(zhì)瘤細胞促炎因子表達增加，且促炎因子的表達升高對α-突觸核蛋白具有濃度依賴性。
　　2.100 nmol/L、300 nmol/L的α-突觸核蛋白單體處理VM星形膠質(zhì)細胞24 h后, IL-1βmRNA的升高分別約為對照組的9.58、21.7倍，TNF-αmRNA的

7、升高分別約為對照組的4.80、6.17倍，與對照組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.0001），且100 nmol/L組與300 nmol/L組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。以上結(jié)果說明，α-突觸核蛋白單體能夠引起VM星形膠質(zhì)細胞促炎因子表達增加，且促炎因子的升高對α-突觸核蛋白具有濃度依賴性。
　　3.100μmol/Lα-突觸核蛋白單體37℃恒溫振蕩3 d，制備α-突觸核蛋白纖維體。100 nmol/L、300 nmol/

8、L的α-突觸核蛋白纖維體處理VM星形膠質(zhì)細胞24 h后，IL-1βmRNA的升高分別約為對照組的3.22、7.91倍，TNF-αmRNA的升高分別約為對照組的3.09、4.33倍，與對照組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且100 nmol/L組與300 nmol/L組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。α-突觸核蛋白纖維體引起促炎因子的升高水平低于α-突觸核蛋白單體組，與α-突觸核蛋白單體組相比，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）

9、。以上結(jié)果說明，α-突觸核蛋白纖維體也能夠引起VM星形膠質(zhì)細胞促炎因子表達增加，且促炎因子的升高對α-突觸核蛋白具有濃度依賴性；但α-突觸核蛋白單體對VM星形膠質(zhì)細胞的毒性要高于α-突觸核蛋白纖維體。
　　4.100 nmol/L的α-突觸核蛋白單體處理C6膠質(zhì)瘤細胞24 h后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白CHOP、ATF-4、XBP-1s的表達升高，分別約為對照組的1.33、2.05、1.24倍，與對照組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05

10、）。300 nmol/L的α-突觸核蛋白組，CHOP、ATF-4、XBP-1s的表達升高，分別約為對照組的1.50、2.10、1.25倍，與對照組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。以上結(jié)果說明，細胞外的α-突觸核蛋白能夠誘導(dǎo)C6膠質(zhì)瘤細胞出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。自噬溶酶體途徑（autophagy-lysosome pathway, ALP）抑制劑氯喹（40μmol/L）或泛素蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome syste

11、m, UPS）抑制劑MG132（20μmol/L）單獨處理細胞24 h后，CHOP、ATF-4的表達升高，提示抑制ALP或UPS均可誘導(dǎo)細胞出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。氯喹與α-突觸核蛋白共孵育后與單獨氯喹處理組相比沒有顯著差別，提示進入細胞內(nèi)的α-突觸核蛋白能夠經(jīng)UPS降解。而MG132與α-突觸核蛋白共孵育后與單獨MG132處理組相比明顯下降，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.0001）。以上結(jié)果說明，進入到細胞內(nèi)的α-突觸核蛋白可以誘導(dǎo)C6膠質(zhì)瘤細胞

12、出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；細胞外進入到細胞內(nèi)的α-突觸核蛋白可以經(jīng)UPS和ALP降解，且ALP在UPS被抑制的情況下更容易被細胞外的α-突觸核蛋白誘導(dǎo)增強。
　　5.100 nmol/L的α-突觸核蛋白單體處理VM星形膠質(zhì)細胞24 h后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白CHOP、ATF-4、XBP-1s的表達升高，分別約為對照組的1.96、2.23、1.29倍，與對照組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。300 nmol/L的α-突觸核蛋白組，CHOP

13、、ATF-4、XBP-1s的表達升高，分別約為對照組的2.02、2.32、1.48倍，與對照組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。以上結(jié)果說明，α-突觸核蛋白能夠誘導(dǎo)VM星形膠質(zhì)細胞出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　6.10μmol/L、100μmol/L枸櫞酸鐵銨（ferric ammonium citrate, FAC）處理C6膠質(zhì)瘤細胞24 h后，10μmol/L FAC組促炎因子表達量較對照組沒有變化，與100 nmol/L的α-突

14、觸核蛋白單體共孵育細胞24 h后，促炎因子的表達量較α-突觸核蛋白組沒有顯著變化。100μmol/L FAC組促炎因子表達量較對照組增加，IL-1β、TNF-αmRNA的升高約為對照組的1.72、1.37倍，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與100 nmol/L的α-突觸核蛋白單體共孵育細胞24 h后，促炎因子的表達量較α-突觸核蛋白組也沒有顯著變化。以上結(jié)果說明，C6膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)鐵水平升高對細胞外α-突觸核蛋白的毒性作用沒有明顯影響

15、。
　　7.10μmol/L FAC處理VM星形膠質(zhì)細胞24 h后，促炎因子IL-1β、TNF-α的mRNA表達水平有升高的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與100 nmol/L的α-突觸核蛋白單體共孵育VM星形膠質(zhì)細胞24 h后，可誘導(dǎo)α-突觸核蛋白引起的促炎因子釋放量增加，與對照組相比，IL-1β、TNF-αmRNA分別約升高11.92、4.95倍，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.0001）；與α-突觸核蛋白組相比，IL-1β

16、、TNF-αmRNA分別約升高26%、18%，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。100μmol/L FAC處理VM星形膠質(zhì)細胞24 h后，促炎因子IL-1β、TNF-α的mRNA表達水平也有升高的趨勢，且與對照組相比，TNF-αmRNA的升高有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與100 nmol/L的α-突觸核蛋白單體共孵育細胞24 h后，可誘導(dǎo)α-突觸核蛋白引起的促炎因子表達量增加，與對照組相比，IL-1β、TNF-αmRNA分別約升高11

17、.59、6.05倍，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.0001）；與α-突觸核蛋白組相比，IL-1β、TNF-αmRNA分別約升高22%、44%，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。以上結(jié)果說明，原代培養(yǎng)的VM星形膠質(zhì)細胞內(nèi)鐵水平升高增強細胞外α-突觸核蛋白的毒性作用。
　　8.100μmol/L FAC處理VM星形膠質(zhì)細胞24 h后，CHOP、ATF-4、XBP-1s的表達有升高的趨勢，且與對照組相比，ATF-4的升高有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0

18、.01），100 nmol/L的α-突觸核蛋白與100μmol/L FAC共孵育VM星形膠質(zhì)細胞24 h后，CHOP、ATF-4、XBP-1s的表達升高，與對照組相比，分別約升高1.61、1.93、2.26倍，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；與α-突觸核蛋白組相比，CHOP、ATF-4、XBP-1s分別約升高1.24、1.25、1.76倍，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。以上結(jié)果說明，原代培養(yǎng)的VM星形膠質(zhì)細胞內(nèi)鐵水平升

19、高增強細胞外α-突觸核蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　9.100 nmol/L、300 nmol/L的α-突觸核蛋白單體處理VM神經(jīng)元24 h后，與對照組相比ΔΨm分別下降12%、15%，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。100 nmol/L的α-突觸核蛋白單體處理VM神經(jīng)元24 h后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白CHOP、ATF-4、XBP-1s的表達升高，分別約為對照組的1.62、1.26、1.21倍，與對照組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0

20、.05）。300 nmol/L的α-突觸核蛋白組，CHOP、ATF-4、XBP-1s的表達升高，分別約為對照組的1.33、1.25、1.28倍，與對照組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。以上結(jié)果說明，α-突觸核蛋白能夠誘導(dǎo)VM神經(jīng)元出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　以上結(jié)果表明，細胞外的α-突觸核蛋白單體能夠引起C6膠質(zhì)瘤細胞和VM星形膠質(zhì)細胞促炎因子IL-1β、TNF-α的mRNA表達水平的升高，并且α-突觸核蛋白纖維體也引起促炎因子的

21、升高，但是升高水平低于α-突觸核蛋白單體組，表明細胞外進入細胞內(nèi)的α-突觸核蛋白能夠引起VM星形膠質(zhì)細胞促炎因子表達水平增加，且α-突觸核蛋白單體的毒性要高于α-突觸核蛋白纖維體。進入到細胞內(nèi)的α-突觸核蛋白可以經(jīng)UPS和ALP途徑降解，且ALP在UPS被抑制的情況下激活更明顯。細胞外的進入到細胞內(nèi)的α-突觸核蛋白可誘導(dǎo)C6膠質(zhì)瘤細胞和VM星形膠質(zhì)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白CHOP、ATF-4、XBP-1s的表達升高。細胞內(nèi)高鐵會進一步增強