體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞在機(jī)械損傷后逆分化為神經(jīng)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）移植是目前被認(rèn)為是治療中樞神經(jīng)損傷最有臨床應(yīng)用前景的細(xì)胞，但NSC的來源、致瘤性以及移植后的排異反應(yīng)等諸多方面的問題又面臨著巨大的挑戰(zhàn)。研究發(fā)現(xiàn)：在神經(jīng)系統(tǒng)損傷（機(jī)械性、化學(xué)性或病理損傷）時(shí)，損傷區(qū)周圍的AST能夠表達(dá)nestin，且呈現(xiàn)神經(jīng)前體細(xì)胞或NSC特性，經(jīng)過培養(yǎng)可以獲得NSC，這一現(xiàn)象的發(fā)生機(jī)理不甚清楚。 據(jù)推測可能與AST周圍分子微環(huán)境變化引起其逆分化有關(guān)。因此AST逆分化的特性為神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)

2、、退行性疾病及腦腫瘤的治療提供了一條蹊徑。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖峭ㄟ^模擬體內(nèi)建立體外的損傷模型，觀察AST在機(jī)械損傷區(qū)和遠(yuǎn)離損傷區(qū)的nestin表達(dá)的變化及逆分化形成NSC的情況，同時(shí)應(yīng)用損傷AST培養(yǎng)體系產(chǎn)生條件培養(yǎng)基來干預(yù)正常生長的AST,進(jìn)一步研究正常生長AST形成神經(jīng)前體細(xì)胞/NSC情況以及AST 逆分化的可能性。最后采用蛋白技術(shù)對條件培養(yǎng)基的活性進(jìn)行篩選分析,探討誘使AST逆分化的細(xì)胞因子及可能存在的作用機(jī)制。為下一步從蛋白和基因水平研

3、究引起AST逆分化為NSC的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)，也為臨床上采用促AST逆分化活性分子治療神經(jīng)損傷提供理論依據(jù)。 本研究共分為五部分。在第一實(shí)驗(yàn)部分中，我們成功建立了一種培養(yǎng)高純度和高細(xì)胞活性的脊髓AST方法，應(yīng)用這種方法培養(yǎng)的脊髓AST，然后對培養(yǎng)的AST的細(xì)胞活性，細(xì)胞純度，細(xì)胞周期進(jìn)行分析，結(jié)果證明：這種培養(yǎng)脊髓AST方法可以有效排除非AST的污染，獲得的AST具有活性高、增殖力強(qiáng)以及純度高（可達(dá)99％以上）的特點(diǎn)，同時(shí)這種

4、分離培養(yǎng)方法省時(shí)省力且操作簡便可行，為應(yīng)用AST作為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯康於ɑA(chǔ)。 在第二部分實(shí)驗(yàn)中，首先建立AST機(jī)械損傷的模型，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色和及Westren-blot方法對對損傷后1-7d的AST在不同時(shí)間點(diǎn)對GFAP和Nestin表達(dá)的變化進(jìn)行了觀察和檢測，同時(shí)應(yīng)用BrdU染色檢測AST損傷后細(xì)胞增殖的變化；最后應(yīng)用NSC條件培養(yǎng)基培養(yǎng)這些損傷的AST并觀察AST在損傷后的逆分化形成神經(jīng)干細(xì)胞的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)： A

5、ST在損傷后1-7d，Nestin表達(dá)不斷發(fā)生變化，在損傷初期Nestin表達(dá)僅局限于損傷區(qū)的部分細(xì)胞，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長Nestin陽性細(xì)胞數(shù)量不斷增加而且由損傷區(qū)向遠(yuǎn)離損傷區(qū)的方向擴(kuò)散。Western-blot結(jié)果證實(shí)AST在損傷后1-7d，Nestin表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢，其表達(dá)的相對光密度由0.404升至0.707，而GFAP表達(dá)量不斷下降，其表達(dá)的相對光密度值由0.86降至0.721，而對照組沒有明顯的Nestin表達(dá)；BrdU染色

6、發(fā)現(xiàn)，AST在損傷后損傷區(qū)BrdU+細(xì)胞數(shù)量隨著培養(yǎng)時(shí)間延長不斷增加，其比例由13.4％增至55.3％，培養(yǎng)至7d時(shí)達(dá)到43.2％，略有下降，但仍明顯高于對照組7.9％；將損傷后的AST用干細(xì)胞條件培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),可以產(chǎn)生神經(jīng)干細(xì)胞球,經(jīng)RA和含血清的培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化可以產(chǎn)生神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，這些結(jié)果可以提示AST損傷后可以發(fā)生逆分化反應(yīng)。 在第三部分實(shí)驗(yàn)中，為了進(jìn)一步探討AST機(jī)械損傷后的發(fā)生逆分化的是由損傷后AST產(chǎn)生某

7、些可溶性信號分子引起，還是由AST 之間的細(xì)胞間網(wǎng)絡(luò)通訊（縫隙連接）和無所不在的鈣震蕩導(dǎo)致或二者協(xié)同作用的結(jié)果。我們將正常的AST置入損傷的AST培養(yǎng)體系中進(jìn)行細(xì)胞不接觸的聯(lián)合培養(yǎng)，然后觀察生長在AST損傷環(huán)境中正常AST細(xì)胞學(xué)特性的變化。通過應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)對與損傷的AST聯(lián)合培養(yǎng)的AST 進(jìn)行GFAP和Nestin染色，觀察它們在不同培養(yǎng)時(shí)間后表達(dá)的變化并且對不同染色情況的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時(shí)對聯(lián)合培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行BrdU染色，

8、檢測AST增殖的情況；另外對不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞的周期進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，分析AST細(xì)胞的周期變化； 最后應(yīng)用NSC條件培養(yǎng)基對這些AST培養(yǎng)，研究AST在損傷環(huán)境中逆分化形成神經(jīng)干細(xì)胞的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn): 將正常的AST與損傷的AST聯(lián)合培養(yǎng)后，在聯(lián)合培養(yǎng)1d后，有少量呈現(xiàn)斑塊狀的著色的Nestin+細(xì)胞，而且染色比較/Nestin 淡，GFAP染色比較強(qiáng)烈，GFAP++的細(xì)胞相對較少，僅有24.4％。此時(shí)也有少量的GFAP-/N

9、estin+它們所占比例為3.6％；培養(yǎng)到3d后，GFAP+/Nestin+細(xì)胞數(shù)目不斷增加可達(dá)72.9％，而且Nestin在細(xì)胞中的表達(dá)明顯增強(qiáng)；與此同時(shí)GFAP+/Nestin-細(xì)胞數(shù)目在減少（18.2％），而GFAP-/Nestin+細(xì)胞數(shù)目已增加到6.8％，總的細(xì)胞密度在增加，且Nestin染色呈現(xiàn)強(qiáng)陽性反應(yīng)的細(xì)胞在不斷增加；培養(yǎng)5d后， GFAP+/Nestin+數(shù)目可達(dá)78.6％,GFAP-/Nestin+的細(xì)胞數(shù)也有所增加

10、達(dá)到10.5％，GFAP+/Nestin-降至6.4％。 而對照組的細(xì)胞沒有明顯的GFAP+/Nestin+陽性細(xì)胞出現(xiàn)，基本都是GFAP+/Nestin-的細(xì)胞。經(jīng)過BrdU染色我們發(fā)現(xiàn)在聯(lián)合培養(yǎng)1d，3d，5d時(shí)，BrdU陽性細(xì)胞所占比例分別13.9％，19.6％，25.68％。通過流式細(xì)胞儀對細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，當(dāng)聯(lián)合培養(yǎng)1d，3d，5d后細(xì)胞周期也發(fā)生了明顯的變化，處于G2期細(xì)胞的百分比由16.4％增至23.2％,而對照

11、組細(xì)胞基本都滯留在G0/G1, 處于G2期的細(xì)胞比例一直都低于7.1％。將這些細(xì)胞用干細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)可以得到具有多向分化潛能的NSC, 進(jìn)行誘導(dǎo)分化后可以產(chǎn)生神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，但是這些神經(jīng)球分化很不一致，具有異質(zhì)性。以上結(jié)果可以提示：AST損傷后發(fā)生的逆分化可能是通過產(chǎn)生可溶性分子介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)。其次AST逆分化產(chǎn)生的神經(jīng)前體細(xì)胞/NSC分化后具有異質(zhì)性。 在第四部分實(shí)驗(yàn)中，為了進(jìn)一步證明條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)AST發(fā)生逆分化的可能

12、性以及探討誘導(dǎo)AST發(fā)生逆分化的機(jī)制，在本實(shí)驗(yàn)中，我們用AST損傷條件培養(yǎng)基培養(yǎng)正常AST，觀察這些AST產(chǎn)生神經(jīng)前體細(xì)胞和RG情況。 實(shí)驗(yàn)采用G5無血清和有血清培養(yǎng)基培養(yǎng)損傷的AST，然后用其培養(yǎng)正常的AST，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無血清組的AST在3d后能夠形成RG樣細(xì)胞，經(jīng)過RC-2免疫細(xì)胞化學(xué)染色，這些具有RG樣的細(xì)胞形態(tài)且呈現(xiàn)RC-2陽性反應(yīng)，有血清組AST在培養(yǎng)5d后也可以產(chǎn)生RC-2免疫反應(yīng)陽性形似RG的細(xì)胞，且RG的產(chǎn)生隨著培

13、養(yǎng)時(shí)間延長不斷增加。同時(shí)對兩組細(xì)胞進(jìn)行Pax-6進(jìn)行半定量RT-PCR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)后的AST可以表達(dá)Pax-6,且表達(dá)的量無血清組在3d和5d時(shí)分別為0.421和0.539，有血清組在5d和10d時(shí)分別為0.586和1.09。其次對兩組細(xì)胞進(jìn)行RC2和Nestin免疫雙標(biāo)染色，發(fā)現(xiàn)兩組的細(xì)胞都有RC2+/Nestin+雙陽性的細(xì)胞產(chǎn)生，但無血清組的比例相對較高。最后對細(xì)胞進(jìn)行了A2B5和GFAP雙標(biāo)染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著

14、培養(yǎng)時(shí)間的延長細(xì)胞由GFAP+/A2B5-逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)镕AP-/A2B5+。這些結(jié)果提示：AST損傷條件培養(yǎng)基可以誘導(dǎo)AST逆向分化為RG和膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞，這種逆行分化現(xiàn)象視乎不受血清影響。 在第五部分實(shí)驗(yàn)中，我們對AST損傷條件培養(yǎng)基中活性分子進(jìn)行初步分離和活性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：AST損傷后能夠產(chǎn)生的促AST發(fā)生逆分化的分子，這些分子可能存在多種，它們可能位于不同分子量范圍，對AST產(chǎn)生逆分化效應(yīng)通過協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)。經(jīng)過初步篩選

15、得到促AST逆分化的活性分子的分子量位于30-70kd，但是這一區(qū)段的分子誘導(dǎo)AST逆分化形成的神經(jīng)球生長的速度比較緩慢，同時(shí)經(jīng)過分化誘導(dǎo)產(chǎn)生的少突膠質(zhì)細(xì)胞相對多,從以上的結(jié)果可以提示對此區(qū)段分子發(fā)生逆分化反應(yīng)的AST可能只是AST的一種亞型。 綜上所述，AST在體外機(jī)械損傷情況下能夠逆分化產(chǎn)生神經(jīng)干細(xì)胞，而且損傷后可釋放一些可溶性活性分子，這些分子能夠促使培養(yǎng)的AST發(fā)生逆分化，這種逆分化發(fā)生機(jī)制可能要經(jīng)歷向RG和膠質(zhì)細(xì)胞前體