神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及分化的相關(guān)研究.pdf

1、本課題是關(guān)于神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及分化方面的研究。 立題一：低溫保存流產(chǎn)兒脊髓神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng) 為了比較不同來源神經(jīng)干細(xì)胞的特性，探尋適合移植治療的神經(jīng)干細(xì)胞來源，人們已經(jīng)從除成人脊髓外的人胚和成人各個(gè)腦區(qū)分離神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行研究，這些人體神經(jīng)組織大部分都是新鮮取材立即培養(yǎng)，少部分取材后經(jīng)過營(yíng)養(yǎng)液中的短暫保存后培養(yǎng)，然而工作中常遇到不能立即取材的情況，因此本立題將14周齡流產(chǎn)兒不經(jīng)任何處理置于冰箱中低溫保存一段時(shí)間后，分

2、段進(jìn)行脊髓神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)，檢測(cè)能否分離培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞，并對(duì)分離的干細(xì)胞的克隆形成能力、分化潛能等性質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步分析比較。 立題二：新生小鼠端腦多能神經(jīng)前體細(xì)胞分化成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的研究 神經(jīng)干細(xì)胞移植到宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)后的遷移分化情況在很大程度上受移植處微環(huán)境的影響，損傷后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)則對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的分化更具選擇性作用，植入的神經(jīng)干細(xì)胞大多分化成膠質(zhì)細(xì)胞，這也是利用神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)修復(fù)需要解決的問題。為了使移植的

3、細(xì)胞如期分化為神經(jīng)元細(xì)胞，人們嘗試了神經(jīng)元前體細(xì)胞移植，雖然神經(jīng)元前體細(xì)胞在移植后不分化成膠質(zhì)細(xì)胞，但在損傷區(qū)的成熟受到限制，即表達(dá)特異類型的神經(jīng)遞質(zhì)受到限制。因此在移植前把干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成特定類型的神經(jīng)元更具可行性。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元因其在神經(jīng)疾病中的重要性及發(fā)育機(jī)制相對(duì)清楚，是目前誘導(dǎo)分化研究較多的神經(jīng)元類型。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元已經(jīng)證明能夠從胚胎干細(xì)胞及胚胎神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化，本立題探尋新生期小鼠端腦多能神經(jīng)前體細(xì)胞是否能夠分化成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，并探尋

4、提高其分化效率的方法，為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元誘導(dǎo)分化提供新的細(xì)胞來源。 立題三：OMgp對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響 神經(jīng)干細(xì)胞植入成體非神經(jīng)發(fā)生部位或損傷區(qū)絕大部分分化成膠質(zhì)細(xì)胞，但植入發(fā)育期神經(jīng)組織中能夠分化成神經(jīng)元，目前還不清楚造成這種差異的原因。發(fā)育期中樞神經(jīng)系統(tǒng)與成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)的區(qū)別之一在于成體有發(fā)育完好的髓鞘，而且髓鞘是脊髓損傷后抑制軸突再生的主要局部環(huán)境因素之一，那么，前述神經(jīng)干細(xì)胞移植后的分化現(xiàn)象是否也與髓鞘有關(guān)呢?因

5、此，本立題探討髓鞘的主要活性成份之一OMgp(oligodendrocyte-myelin glycoprotein)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化是否具有影響，同時(shí)探討OMgp對(duì)干細(xì)胞源性神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)是否也有的影響，并檢測(cè)NGF、dbcAMP(dibutyryl cAMP)對(duì)OMgp是否具有對(duì)抗作用。 研究材料與方法： 立題一：14周流產(chǎn)兒在4℃下保存，于2 h、6 h和12 h后取脊髓，頸段、胸段、腰骶段分別進(jìn)行無血清培養(yǎng)，并用

6、胎牛血清誘導(dǎo)分化。用克隆培養(yǎng)的方法驗(yàn)證培養(yǎng)細(xì)胞的干細(xì)胞特性。用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的方法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志nestin及干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后神經(jīng)元標(biāo)志MAP2、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志GFAP、膽堿能標(biāo)志CkAT，比較不同時(shí)間點(diǎn)以及不同部位分離神經(jīng)干細(xì)胞的差異。 立題二：取新生小鼠端腦進(jìn)行多能神經(jīng)前體細(xì)胞的分離培養(yǎng)，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，8～10天后用5％胎牛血清誘導(dǎo)分化，并用RA(retinoic acid)、Shh(sonichedgehog

7、)以及dbeAMP來提高運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的分化效率，利用免疫熒光的方法檢測(cè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元標(biāo)志物MAP2、ChAT及HB9來證明運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的分化；利用神經(jīng)前體細(xì)胞與骨骼肌共同培養(yǎng)，通過免疫熒光方法檢測(cè)MAP2、N-AChR共存來證明分化運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元與肌細(xì)胞能夠形成突觸結(jié)構(gòu)，并運(yùn)用藥理學(xué)方法證明突觸能夠傳遞沖動(dòng)。 立題三：取新生小鼠端腦進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)，用5％胎牛血清誘導(dǎo)分化，并將其分為四組：將分化培養(yǎng)分成4個(gè)組，組1為陰性對(duì)照，組2加

8、入終濃度為50ng/ml OMgp，組3加入終濃度為50ng/ml OMgp+100 ng/ml NGF，組4加入終濃度為50 ng/ml OMgp+1000μMdbcAMP，培養(yǎng)4天后用免疫熒光的方法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞分化后神經(jīng)元標(biāo)志MAP2、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志GFAP，并計(jì)算并比較各組神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞的比例，測(cè)量并比較各組神經(jīng)元軸突的長(zhǎng)度。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 立題一：在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，頸段、胸段、腰骶段脊髓均分離培養(yǎng)出具有連續(xù)增殖

9、能力的神經(jīng)球，腰骶段分離出的神經(jīng)球數(shù)量最多，12h組各段分離出的神經(jīng)球較2 h、6h組顯著減少。各培養(yǎng)中神經(jīng)球均為nestin陽(yáng)性，誘導(dǎo)分化后均能夠產(chǎn)生GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞、MAP2陽(yáng)性神經(jīng)元以及ChAT陽(yáng)性的膽堿能神經(jīng)元。各培養(yǎng)中神經(jīng)干細(xì)胞的克隆形成能力相似。 立題二：從新生小鼠端腦成功分離培養(yǎng)多能神經(jīng)前體細(xì)胞，具有連續(xù)增殖能力，能分化形成MAP2陽(yáng)性神經(jīng)元以及GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，4％的分化細(xì)胞為ChAT<'+>的膽

10、堿能神經(jīng)元，1％的細(xì)胞表達(dá)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元特異性標(biāo)志物HB9，當(dāng)加入運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元誘導(dǎo)因子后，HB9<'+>細(xì)胞數(shù)增加到5％。神經(jīng)前體細(xì)胞與骨骼肌細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)可見分化的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元與骨骼肌形成突觸結(jié)構(gòu)，并能夠傳導(dǎo)沖動(dòng)。 立題三：神經(jīng)干細(xì)胞正常分化培養(yǎng)中MAP2陽(yáng)性神經(jīng)元比例13.85％，GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞比例3.15％，加入OMgp后神經(jīng)元比例降至3.40％，星形膠質(zhì)細(xì)胞比例升至6.01％，同時(shí)軸突生長(zhǎng)受抑；NGF和dbcAMP對(duì)OM

11、gp有拮抗作用。 研究討論： 立題一：克隆培養(yǎng)證明本研究中分離的細(xì)胞能夠自我更新、擴(kuò)增，能夠分化成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要細(xì)胞，符合干細(xì)胞的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)。腰骶段能夠分離更多的神經(jīng)球說明腰骶段有更多有反應(yīng)能力的干細(xì)胞或腰骶段的干細(xì)胞有更強(qiáng)的存活能力。隨流產(chǎn)兒體外保存時(shí)間的延長(zhǎng)，分離的神經(jīng)球數(shù)量減少，說明干細(xì)胞死亡逐漸增加。脊髓各節(jié)段分離的細(xì)胞具有相似的克隆形成能力及分化能力，本質(zhì)上可認(rèn)為是同種細(xì)胞。 立題二：從新生小鼠端腦分

12、離細(xì)胞具有連續(xù)增殖能力，能分化形成神經(jīng)元以及星形膠質(zhì)細(xì)胞符合多能神經(jīng)前體細(xì)胞評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)。部分分化細(xì)胞表達(dá)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元特異性分子標(biāo)志HB9說明分化培養(yǎng)中有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的產(chǎn)生。分化的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元能與骨骼肌細(xì)胞形成突觸并傳導(dǎo)沖動(dòng)，說明這些運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元具有功能性。 立題三：OMgp促神經(jīng)干細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞方向分化，抑制神經(jīng)元方向的分化；NGF對(duì)其有對(duì)抗作用；dbcAMP也具對(duì)抗作用提示OMgp發(fā)揮作用可能通過NgR通路。 研究結(jié)論：