TRB3基因參與高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究.pdf

1、β細(xì)胞功能衰竭是2型糖尿病晚期一個(gè)重要的特征，高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能衰竭的主要原因之一。研究高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制對(duì)闡明2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展，以及對(duì)糖尿病的防治都具有重要的意義。 Tribbles同源蛋白3(tribbleshomolog3，TRB3)是新發(fā)現(xiàn)的一種具有廣泛生物學(xué)功能的基因。TRB3可以和AKT/PKB(proteinkinsaseB)結(jié)合抑制胰島素信號(hào)通路，參與胰島素抵抗的發(fā)生；通

2、過(guò)ATF4/CHOP(activatingtranscriptionfactor4/CCAAT/enhancerbindingproteinshomologusprotein)通路參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控。目前TRB3基因是否參與高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡的研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。 目的： 研究高糖條件下TRB3基因的表達(dá)情況，以及TRB3基因過(guò)表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡的影響和可能涉及的分子機(jī)制。 方法：

3、應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR(real-timequantitativepolymerasechainreaction，real-timePCR)檢測(cè)糖尿病GK大鼠(Goto-KakizakiWistarrat，GKrat)胰島細(xì)胞和高糖刺激的INS-1細(xì)胞中TRB3基因mRNA的表達(dá)。應(yīng)用Tet-on系統(tǒng)將TRB3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到INS-rβ(r9)細(xì)胞內(nèi)，構(gòu)建可誘導(dǎo)TRB3基因表達(dá)的β細(xì)胞系。采用real-timePCR和細(xì)胞免疫熒光方法證實(shí)所構(gòu)建

4、的β細(xì)胞TRB3基因的可誘導(dǎo)性。應(yīng)用免疫蛋白印記(WesternBlot)分析強(qiáng)力土霉素(doxycycline，DOX)誘導(dǎo)β細(xì)胞TRB3基因表達(dá)的量-效和時(shí)-效關(guān)系。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附分析(enzymelinkedimmuneosorbentassay，EILSA)和MTT法分別檢測(cè)TRB3基因過(guò)表達(dá)對(duì)β細(xì)胞胰島素分泌和細(xì)胞增殖的影響。應(yīng)用DNA片段化、TUNEL、AnnexinV/PI流式細(xì)胞儀分析高糖條件下TRB3過(guò)表達(dá)對(duì)β細(xì)胞凋

5、亡的影響，以及RNA干擾TRB3基因表達(dá)對(duì)β細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察TRB3基因過(guò)表達(dá)的β細(xì)胞線粒體形態(tài)和細(xì)胞色素C分布。應(yīng)用WesternBlot和ELISA分別檢測(cè)細(xì)胞色素C含量和capase-3活性。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TRB3基因過(guò)表達(dá)對(duì)β細(xì)胞線粒體膜電位(membranepotential，△ψm)和反應(yīng)性活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)產(chǎn)生的影響。 結(jié)果： 糖尿病

6、GK大鼠胰島細(xì)胞中TRB3mRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯升高，高糖可以明顯上調(diào)INS-1細(xì)胞中TRB3基因mRNA的表達(dá)。采用Tet-on系統(tǒng)，我們建立了TRB3基因可誘導(dǎo)的β細(xì)胞系。DOX可以誘導(dǎo)TRB3基因在此細(xì)胞系中的表達(dá)，并表現(xiàn)明顯的量-效和時(shí)-效關(guān)系。在高糖條件下，TRB3基因過(guò)表達(dá)可以抑制β細(xì)胞的增殖并減少胰島素的分泌。采用DNA片段法，TUNEL染色和流式細(xì)胞分析都證實(shí)，TRB3基因過(guò)表達(dá)明顯促進(jìn)高糖引起的β細(xì)胞凋亡。采用

7、siRNA干擾技術(shù)抑制TRB3基因在β細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，則可明顯降低高糖誘導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，TRB3基因過(guò)表達(dá)的β細(xì)胞的線粒體形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞色素C的分布出現(xiàn)異常。WesternBlot顯示細(xì)胞色素C釋放增加。ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TRB3過(guò)表達(dá)的β細(xì)胞中Caspase-3的活性升高。流式細(xì)胞儀分析顯示，TRB3過(guò)表達(dá)促進(jìn)β細(xì)胞線粒體△ψm下降和ROS含量增加。以上結(jié)果提示，這些因素可能與TRB3基因參與高糖誘導(dǎo)胰島