PEG修飾的rh FGF-2對PD大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用.pdf

1、目的:采用立體定位技術(shù)用6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導(dǎo)的帕金森癥(PD)大鼠模型已被廣泛的應(yīng)用于基礎(chǔ)研究，本文利用6-OHDA構(gòu)建大鼠PD模型，選取造模成功的PD模型大鼠，研究聚乙二醇(PEG)修飾后的堿性成纖維細(xì)胞生長因子（rh FGF-2）對PD大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，并探索其對帕金森癥的作用功效。
　　 方法:
　　 一、6-OHDA構(gòu)建PD大鼠模型
　　 取體重300克左右的雄性SD大鼠82只，隨機(jī)選取造

2、模組大鼠70只用腦立體定位儀給大鼠腦內(nèi)注射6-OHDA制備大鼠PD模型，隨機(jī)選取對照組6只注射等量的溶劑，其余6只作為空白組不作任何處理。術(shù)后觀察各組的阿樸嗎啡(APO)誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為學(xué)變化。各組隨機(jī)選取6只進(jìn)行剖殺，觀察組織形態(tài)的變化以及神經(jīng)生化變化，以此來判定PD模型是否構(gòu)建成功。選擇模型成功的PD大鼠(54只)，另外選取同一批次SD健康大鼠18只作為空白組，繼續(xù)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　 二、PEG rhFGF-2對PD大鼠的

3、長效神經(jīng)保護(hù)和更好的功效
　　 (1) PD大鼠中的神經(jīng)保護(hù)選取PD模型成功的大鼠54只隨機(jī)分為3組，每組18只，即PEG修飾的rhFGF-2組;野生型rh FGF-2組，以及模型組?？瞻捉M為18只健康SD大鼠。模型成功后次日開始藥物治療。PEG修飾的rh FGF-2組以100ug/kg劑量尾靜脈注射聚乙二醇修飾的堿性成纖維細(xì)胞生長因子（rh FGF-2），野生型rh FGF-2組以同樣濃度同等劑量尾靜脈注射野生型FGF-2，模

4、型組不作處理;對照組給同樣劑量的藥物溶劑PBS，空白組不作任何處理;連續(xù)注射2周后，每組取6只大鼠觀察APO誘導(dǎo)大鼠的行為學(xué)變化;每組隨機(jī)取6只用HPLC-ECD檢測大鼠相關(guān)腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量變化情況;ELISA法檢測rhFGF-2在紋狀體中的含量;另外6只免疫組化技術(shù)檢測相關(guān)神經(jīng)元的形態(tài)和數(shù)量等變化情況;western blot技術(shù)檢測相關(guān)腦組織中蛋白含量的變化。
　　 (2) PC12細(xì)胞中的神經(jīng)保護(hù)PC12細(xì)胞培

5、養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，將細(xì)胞分4組:給藥組1、2、3以及對照組。當(dāng)傳代細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期時，饑餓24小時后開始實(shí)驗(yàn)。將6-OHDA加入到培養(yǎng)基中建立PC12細(xì)胞的PD模型，給藥組1、2分別給予PEG rh FGF-2或者野生型FGF-2(4μM)，2小時后，分別給予6-OHDA（20mM，8小時）;給藥組3僅給予6-OHDA（20mM，8小時），給藥后MTT法觀察細(xì)胞的存活情況，同時用westernblot技術(shù)檢測凋亡信號通路相關(guān)蛋白C

6、aspase-3的含量變化。
　　 結(jié)果:
　　 一、PD大鼠模型建模成功APO誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為測試中，造模組70只大鼠中有54只大鼠(77.1％)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)穩(wěn)定在7r/min以上，而且總?cè)?shù)大于280r/40min，為合格的PD大鼠;對照組和空白組大鼠均未出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為。行為學(xué)檢測結(jié)果表明6-OHDA構(gòu)建的PD大鼠模型較穩(wěn)定，可以利用54只PD模型大鼠進(jìn)行深入研究。
　　 二、PEG rhFGF-2的長效神經(jīng)保護(hù)作用

7、
　　 (1) PEG修飾的rhFGF-2組與野生型rhFGF-2組相比，大鼠的旋轉(zhuǎn)行為學(xué)降低了70％。然而，給藥組野生型rhFGF-2與模型組的大鼠相比，大鼠的旋轉(zhuǎn)行為學(xué)降低了30％。
　　 (2)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物的檢測中，給藥野生型rhFGF-2組的5種神經(jīng)遞質(zhì)含量與模型組大鼠相比僅僅增加了20％，給藥PEGylated rhFGF-2組的大鼠中神經(jīng)遞質(zhì)含量與模型組大鼠相比有顯著的增加，NE，5-HIT，5-

8、HIAA，DA，HVA，DOPAC的遞質(zhì)含量增加情況分別為57.8％，38％，51.7％，72％，56％，41.6％
　　 (3)對PD大鼠給藥2周后，PEG修飾的rhFGF-2組的TH表達(dá)明顯高于野生型的rhFGF-2組;DAT免疫陽性神經(jīng)元在兩組給藥組均有所增加，野生型的rhFGF-2組IHS值從PD模型大鼠的102±12.64增加到127±14.47，PEG修飾rhFGF-2組增加到165±18.06。GFAP免疫陽性細(xì)胞

9、在PD模型大鼠中有大量表達(dá)。然而給藥的2組大鼠的腦組織中GFAP含量顯著下降了，這種下降在PEG修飾rhFGF-2組中更為明顯，該組的GFAP表達(dá)幾乎類似于對照組。Western Blot結(jié)果表明，DAT在PEG修飾rhFGF-2組中的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PD模型組和野生型的rhFGF-2組。
　　 (4)在給藥（PEG修飾的rh FGF2或野生型rh FGF2）以后，兩組GFAP都保持在低水平，PEG修飾的rh FGF2組大鼠黑質(zhì)和紋

10、狀體中的GFAP幾乎恢復(fù)到了PD造模前的低水平狀態(tài)，甚至直到給藥2周以后第五天仍然沒有顯著差異。
　　 (5)在修飾后的rhFGF-2組，RhFGF-2含量比PD模型組高出很多，且在給藥30分鐘和60分鐘后分別增加到(5.6 ng/mg)和(4.2 ng/mg)。與野生型rh FGF-2組相比，分別增加了驚人的2.67倍和2.46倍。
　　 (6) PC12細(xì)胞經(jīng)6-OHDA處理后，增殖活性被抑制了，當(dāng)給予修飾的rhFG

11、F-2或者野生型rhFGF-2后，PC12細(xì)胞的大量增加的生物活性可以抵抗之前的抑制。經(jīng)過一周的孵育以后，PEG修飾的rhFGF-2比野生型的有更好的促有絲分裂活性。
　　 (7)6-OHDA損傷組的Caspase-3蛋白含量較對照組增加，分別給予PEG修飾的rhFGF-2和野生型rhFGF-2后，與僅給予6-OHDA的組相比，給藥的2組的Caspase-3顯著減少了結(jié)論:
　　 PEG修飾的rh FGF2具有更有效和長