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文檔簡介
1、前言:肺癌是常見的惡性腫瘤之一。對于中晚期及術(shù)后復(fù)發(fā)的肺癌患者,化療是其重要的的治療手段。然而,肺癌對以鉑類為基礎(chǔ)的經(jīng)典化療方案容易產(chǎn)生耐藥,導(dǎo)致化療效果不佳。因此,研究肺癌化療耐藥機(jī)制具有重要意義。許多研究表明,成纖維細(xì)胞生長因子2(Fibroblast growth factor2,F(xiàn)GF-2)可通過抑制細(xì)胞凋亡,參與多種腫瘤耐藥的發(fā)生,但具體機(jī)制不清。最新研究發(fā)現(xiàn),成纖維細(xì)胞生長因子受體1(Fibroblast growth fa
2、ctor receptor1,F(xiàn)GFR1)在肺鱗癌中出現(xiàn)特異性基因擴(kuò)增,F(xiàn)GFR1基因可能是肺鱗癌治療的靶點(diǎn)。FGFR1的生物活性主要是通過與高親和性配體FGF-2結(jié)合而發(fā)揮作用。因此,充分認(rèn)識(shí)FGF-2及FGFR1基因在肺鱗癌中的作用及其機(jī)制具有重要的意義。此外,研究顯示硫氧還蛋白(thioredoxins,TRX)參與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展。然而TRX是否參與FGF-2介導(dǎo)的對肺鱗癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控,目前尚無相關(guān)報(bào)道。
目的:
3、(1)探討FGF-2對肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1中TRX表達(dá)的影響。(2)探討FGF-2對肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1中順鉑誘導(dǎo)凋亡的影響。(3)探討TRX在FGF-2調(diào)控肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1凋亡中可能的作用。
方法:(1)應(yīng)用Western blot檢測FGF-2分別以不同濃度(0、5、10、25、50、75ng/ml)、不同時(shí)間(0、4、8、12、24h)作用后,SK-MES-1細(xì)胞中TRX的蛋白表達(dá)水平,確定FG
4、F-2作用的最佳濃度和時(shí)間。(2)應(yīng)用RT-PCR檢測SK-MES-1細(xì)胞中TRX的mRNA表達(dá)水平。(3) MTT法測定SK-MES-1細(xì)胞中順鉑的半數(shù)抑制濃度IC50(inhibition concentration50%)(4)分析FGF-2對SK-MES-1細(xì)胞凋亡的影響,應(yīng)用Western blot檢測TRX、PARP蛋白表達(dá)水平;應(yīng)用免疫熒光化學(xué)檢測TRX在細(xì)胞內(nèi)的定位和相對定量;Ac-DEVD-pNA法檢測caspase-
5、3酶活性;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡;RT-PCR檢測TRX mRNA的表達(dá)水平。(5)應(yīng)用脂質(zhì)體法將TRX-siRNA轉(zhuǎn)染入SK-MES-1細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率;Western blot檢測TRX-siRNA抑制效率;Annexin V-FITC/PI染色、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。
結(jié)果:
(1) FGF-2以不同濃度作用于SK-MES-1細(xì)胞,10ng/ml FGF-2作用組中TRX表達(dá)明顯上升,為對
6、照組的(1.89±0.08)倍(P<0.05)。
(2)10ng/ml FGF-2以不同時(shí)間作用于SK-MES-1細(xì)胞,8h組中TRX表達(dá)明顯上升,為對照組的(2.31±0.04)倍(P<0.05)。
(3)10ng/ml FGF-2作用8h處理SK-MES-1細(xì)胞前后,以及FGF-2+DDP組、DDP組SK-MES-1細(xì)胞中TRX的mRNA表達(dá)水平無明顯改變(P>0.05)。FGF-2可能在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)S
7、K-MES-1細(xì)胞中TRX的表達(dá)。
(4)以0、3、10、30、75、150、300mg/L DDP作用于SK-MES-1細(xì)胞24h,SK-MES-1細(xì)胞存活率隨DDP濃度增加而下降,作圖估算作用于SK-MES-1細(xì)胞24h時(shí)DDP的IC50,約為30mg/L。
(5) FGF-2可明顯抑制SK-MES-1細(xì)胞中caspase-3的活性及caspase-3底物PARP的活化,抑制率分別為(54.13±1.57
8、)%和(34.46±0.53)%(P<0.05);FGF-2可明顯上調(diào)TRX蛋白的表達(dá)(1.87±0.09)倍(P<0.05)。
(6)肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有TRX表達(dá);正常對照、FGF-2+DDP組、DDP組中的TRX表達(dá)變化趨勢與上述Western blot結(jié)果一致。
(7) FGF-2能明顯抑制順鉑誘導(dǎo)的肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1凋亡,抑制率為(41.77±2.42)%(P<0
9、.05)。
(8) TRX-siRNA可有效抑制SK-MES-1細(xì)胞中TRX蛋白表達(dá),TRX-siRNA-1和TRX-siRNA-3的抑制率分別為(50.49±0.06)%和(54.25±0.03)%(P<0.05)。
(9) FGF-2可明顯抑制饑餓誘導(dǎo)的SK-MES-1細(xì)胞凋亡,抑制率為(43.61±1.52)%(P<0.05);應(yīng)用TRX-siRNA抑制TRX表達(dá)后,SK-MES-1凋亡增加,并可抑制F
10、GF-2的抗凋亡作用,TRX-siRNA組凋亡率為正常對照組的(1.55±0.02)倍(P<0.05),TRX-siRNA+饑餓組凋亡率為饑餓組的(1.42±0.03)倍(P<0.05);TRX-siRNA+FGF2+饑餓組與TRX-siRNA+饑餓組的凋亡率無明顯差別(P>0.05)。
結(jié)論:
(1) FGF-2可上調(diào)肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1的TRX表達(dá)。
(2) FGF-2能抑制順鉑誘導(dǎo)的
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