開心散對Aβ-,25-35-誘導Alzheimer病大鼠模型的作用研究.pdf

1、目的：Alzheimer病是一類原發(fā)退行性灰質(zhì)腦病，潛隱起病，進行性發(fā)展。AD病程長達20年左右，晚期AD患者常有嚴重的精神和神經(jīng)癥狀，生活完全不能自理，嚴重影響老年人的建康并造成了嚴重的社會與經(jīng)濟問題。目前，在臨床上尚無針對其發(fā)病機制的西醫(yī)特效藥。根據(jù)中醫(yī)的理論及實驗，認為AD的病機是本虛標實。本虛主要為腎精虧損和氣血不足；標實主要為痰濁阻竅，氣滯血瘀。歷代中醫(yī)分別采用補腎益髓添精，養(yǎng)心安神，補脾益氣，豁痰開竅，行氣活血等治法應用于臨

2、床，獲得可靠療效。開心散是根據(jù)臨床實踐結(jié)合實驗研究，選出的有效方劑。現(xiàn)多用于治療老年癡呆，神經(jīng)衰弱等。臨床上開心散始見于《備急千金要方》由遠志，人參，茯苓，菖蒲組成。為益氣養(yǎng)心，安神定志之代表方劑。開心散為中藥方劑，可以發(fā)揮其神經(jīng)藥理活性的多樣性，通過不同的途徑，作用于多靶點，從而發(fā)揮其建腦促智作用。 本研究初步探索了開心散對Alzheimer病大鼠模型的作用機制。 方法： (1)老年癡呆大鼠的模型制作：

3、 參照大鼠腦立體定位圖譜具體操作如下：Aβ組，每只大鼠稱重后進行腹腔麻醉(戊巴比妥40mg/kg)后，固定于腦立體定位儀上，剪去頭頂部的毛，消毒后取頭頂部正中線切開頭皮(矢狀切口)，分離皮下組織充分暴露出前囟及其周圍部分的顱骨，鉆穿顱骨，注射器針頭挑破硬腦膜.將溶液抽入微量進樣器中，按如下位點進行定位注射：前囟前0.5mm,腦正中線右側(cè)2.8mm硬腦膜下7.0mm進針至Meynert核.使Aβ-25-35溶液1μ1在5分鐘內(nèi)緩慢注完，注

4、射完畢后留針5分鐘，使殘余在進樣器末端的液體被充分吸收，然后緩緩拔出進樣器，縫合頭皮包扎傷口，將動物放回飼養(yǎng)籠內(nèi)。術后給予青霉素8萬u/只，Ⅰ次/天，共3天。預防感染.連續(xù)給藥28天，第29天開始，進行水迷宮訓練5天，記錄第5天的逃避潛服期，明顯高于假手術組，說明造模成功。 (2)開心散治療Aβ25-35誘導大鼠AD的實驗： 將60只大鼠，隨機分為Aβ組，低劑量開心散治療組，高劑量開心散治療組，腦復康治療組，假手術組，共

5、5組，每組12只。假手術組大鼠右側(cè)Meynert基底核注射1ul的生理鹽水，其余4組右側(cè)Meynert核各注射1ulAβ25-35的。手術后第二天，低劑量開心散治療組和高劑量開心散治療組分別予的開心散0.1g/kg，0.3g/kg灌胃，每天一次。Aβ組予等體積的蒸餾水灌胃。腦復康組予腦復康0.32g/kg連續(xù)灌胃28天。然后用Morris水迷宮法訓練5天，記錄成績。 實驗結(jié)束后，將大鼠麻醉，斷頭取腦。一側(cè)做免疫組化測β-APP,

6、Bax，Bcl-2蛋白的表達，另一側(cè)取腦測膽堿酯酶活性，余下的組織提取RNA，通過RT-PCR方法，檢測Bax,Bcl-2，Trb3mRNA的表達。 結(jié)果： 1.開心散對大鼠學習記憶功能的影響： Morris水迷宮成績測試，隨著訓練的進行，各組大鼠逃避潛伏期逐減縮短。記錄第五天成績,Aβ組與假手術組相比，逃避潛伏期明顯延長，p＜0.01，給予開心散及腦復康治療后，各治療組與Aβ組相比，逃避潛伏期明顯縮短，p＜0.

7、05。 2.乙酰膽堿酯酶活性測試： Aβ組與假手術組相比，活性顯著升高，p＜0.01，給予開心散及腦復康治療后，各治療組與Aβ組相比乙酰膽堿酯酶活性顯著降低，P均＜0.05.大劑量開心散組與小劑量開心散組之間無顯著差異， 3.免疫組化法檢測鼠腦海馬區(qū)APP及bax，bcl-2蛋白的表達： 結(jié)果顯示注射Aβ25-35后，Aβ組鼠腦額葉皮層和海馬區(qū)APP表達明顯升高，與假手術組相比p＜0.01。Bax的表達也

8、明顯升高，與假手術組相比P＜0.01。開心散大劑量組，開心散小劑量組及腦復康組腦額葉皮層和海馬區(qū)APP的表達明顯降低，分別與Aβ組相比，p＜0.05。而且Aβ組與假手術組相比，Bax表達上調(diào),P＜0.01，bcl-2表達下調(diào)P＜0.01。開心散大劑量組，開心散小劑量組及腦復康組分別與Aβ組相比，腦額葉皮層和海馬區(qū)bax的表達明顯降低，p＜0.05，而bcl-2的表達上調(diào)，P＜0.05。 4.RT-PCR測Bax，Bcl-2mRN

9、A的表達： RT-PCR現(xiàn)示注射Aβ25-35后，Aβ組bax表達明顯升高，與假手術組比，P＜0.01，開心散大劑量組，開心散小劑量組及腦復康組分別與Aβ組相比，bax表達降低，P＜0.05。各組bcl-2未檢測到。 5.用PCR測Trb3的表達： 結(jié)論： 1用老年斑的主要構成成分Aβ25-35定位損傷老化大鼠腦Meynert基底核后，結(jié)果顯示模型大鼠腦膽堿能系統(tǒng)遭到損害，功能受損，從而導致大鼠學習能力的

10、障礙。另外，免疫組化顯示bax表達增加，bcl-2表達減少，使Bax/Bcl-2比值增大,real-timePCR顯示trb3基因表達水平顯著高于對照組，提示Aβ25-35等毒性物質(zhì)造成的神經(jīng)元凋亡在以AD為代表的退行性變神經(jīng)疾病的發(fā)生中起重要作用，是出現(xiàn)認知障礙等臨床表現(xiàn)的重要原因之一。 2各組大鼠經(jīng)灌胃開心散后，乙酰膽堿酯酶活性降低，APP生成減少，RT-PCR及免疫組化均顯示Aβ組的bax明顯升高，服藥組與之相比表達明顯下