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1、細(xì)胞移植治療缺血性心肌病已取得較大進(jìn)展,但由于多種因素的制約限制了其治療效果。移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的低存活率是限制其治療效果的重要因素之一,梗死心肌微環(huán)境中除缺血缺氧外,可能還存在多種因素會(huì)誘導(dǎo)MSCs凋亡,其中梗死心臟中由于活性氧(ROS)增高而導(dǎo)致的持續(xù)氧化應(yīng)激可能是誘導(dǎo)MSCs凋亡的另一個(gè)重要因素,研究這些因素及作用機(jī)制有助于尋找抗凋亡的有效途徑。
干細(xì)胞的旁分泌是其治療缺血性心肌病的重要機(jī)制之一。MSC
2、s能夠分泌多種細(xì)胞因子,其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)具有促血管生成和心肌保護(hù)等多種功能,增加MSCs中VEGF分泌能夠顯著提高細(xì)胞移植的治療效果。溶血磷脂酸(Lysophospholipids acid,LPA)作為一種內(nèi)源性磷脂類分子在許多生理和病理過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用。我們前期研究表明LPA預(yù)處理的MSCs增加了心肌梗死區(qū)毛細(xì)血管密度,促進(jìn)MSCs分泌VEGF,但其具體作用機(jī)制尚不明確。作為一種新型磷脂,二酰基甘油焦磷酸(DG
3、PP)常用作LPA1/3受體拮抗劑,目前關(guān)于DGPP對(duì)MSCs生長(zhǎng)調(diào)節(jié)方面的研究還是空白,我們的前期實(shí)驗(yàn)意外發(fā)現(xiàn)DGPP能比LPA更為有效地促進(jìn)VEGF分泌,但其具體的機(jī)制還不明確。而這些磷脂分子對(duì)MSCs的具體作用效果和機(jī)制的闡明將可能為MSCs移植增效提供新的候選藥物。
針對(duì)上述背景,本論文分析了梗死心肌中增高的活性氧化物對(duì)移植MSCs存活的影響以及其作用機(jī)制,分別探討了LPA和DGPP對(duì)MSCs旁分泌的作用及其調(diào)控機(jī)
4、制,研究了LPA對(duì)MSCs的增殖調(diào)控及其相關(guān)信號(hào)通路。本研究主要包括以下四部分內(nèi)容:
1.過(guò)氧化氫對(duì)MSCs存活的影響及其調(diào)節(jié)信號(hào)通路
為研究活性氧化物對(duì)移植干細(xì)胞存活的影響,本研究建立了體外氧化應(yīng)激模型,并對(duì)H2O2誘導(dǎo)MSCs凋亡的機(jī)制進(jìn)行了研究。結(jié)果表明H2O2濃度等于或高于0.9 mM,作用時(shí)間超過(guò)12小時(shí),細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡。H2O2導(dǎo)致細(xì)胞線粒體膜屯位降低,細(xì)胞色素c從線粒體釋放入胞漿,bax從胞漿
5、向線粒體轉(zhuǎn)移。H2O2處理還導(dǎo)致caspase-3和caspas-12的活化,二者的抑制劑不同程度抑制了MSCs的凋亡,而caspase-12抑制劑沒(méi)有抑制細(xì)胞色素C的釋放和caspase-3的切割。H2O2增加JNK和ps8的磷酸化水平,其中p38抑制劑附止了MSCs的早期凋亡,并印制了細(xì)胞色素c的釋放及bax的轉(zhuǎn)移,而JNK抑制劑減少了細(xì)胞的晚期凋亡。因此,H2O2以濃度和時(shí)間依賴性誘導(dǎo)MSCs凋亡,凋亡同時(shí)通過(guò)線粒體途經(jīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)
6、激途徑。H2O2也活化了JNK/p38途經(jīng),其中p38通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體途經(jīng)調(diào)控MSCs的早期凋亡,而JNK調(diào)節(jié)細(xì)胞的晚期凋亡,并獨(dú)立于線粒體途徑。
2.LPA促進(jìn)MSCs分泌VEGF及其調(diào)節(jié)機(jī)制
為研究LPA對(duì)MSCs分泌VEGF的調(diào)控及其機(jī)制,應(yīng)用LPA處理MSCs,分別檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)與定位、ATP酶及離子通道的變化情況,結(jié)果表明LPA以濃度和時(shí)間依賴性促進(jìn)MSCs分泌VEGF,而對(duì)細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白和VE
7、GF mRNA的表達(dá)沒(méi)有影響。LPA抑制了Na+,K+-ATPase活性,上調(diào)了150KD氧調(diào)控蛋白(ORP150)的表達(dá),并減少了VEGF蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的駐留。鉀離子通道開放劑diazoxide抑制了LPA的誘導(dǎo)ORP150表達(dá)增高,同時(shí)也抑制了LPA促進(jìn)的VEGF分泌,增加了VEGF的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留。因此,上述結(jié)果證明LPA在翻譯后水平調(diào)控VEGF分泌,其調(diào)節(jié)途徑如下:LPA降低了MSCs中Na+,K+-ATPase活性,使ATP/AD
8、P下降,線粒體ATP-敏感型鉀離子通道(mitoKATP channel)關(guān)閉,進(jìn)而導(dǎo)致ORP150表達(dá)增高,高表達(dá)的ORP150促進(jìn)VEGF從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向細(xì)胞外運(yùn)輸。
3.DGPP促進(jìn)MSCs分泌VEGF及其調(diào)節(jié)機(jī)制
為檢測(cè)DGPP對(duì)MSCs分泌VEGF的調(diào)節(jié),應(yīng)用DGPP處理MSCs后,檢測(cè)VEGF的分泌,并對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究分析,結(jié)果顯示DGPP顯著促進(jìn)MSCs分泌VEGF,其促VEGF的分泌效果強(qiáng)于LPA
9、。低血清條件下DGPP沒(méi)有顯著改變存活細(xì)胞數(shù)量,高濃度DGPP抑制了MSCs增殖。DGPP沒(méi)有影響細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白和VEGF mRNA的表達(dá)。鉀離子通道開放劑diazoxide沒(méi)有抑制DGPP導(dǎo)致的VEGF分泌增高。DGPP上調(diào)了GRP94 mRNA的表達(dá)。Sulfinator分析預(yù)測(cè)VEGF蛋白存在酪氨酸硫酸化修飾位點(diǎn)。因此,DGPP能夠比LPA更為有效促進(jìn)MSCs中VEGF的分泌,并與細(xì)胞數(shù)量變化無(wú)關(guān)。與LPA不同,DGPP調(diào)節(jié)V
10、EGF可能沒(méi)有涉及mitoKATP通道的調(diào)節(jié)。GRP94、VEGF N-糖基化、酪氨酸硫酸化在DGPP促VEGF分泌過(guò)程中的作用有待進(jìn)一步研究。
4.LPA對(duì)MSCs增殖的調(diào)節(jié)作用及其作用機(jī)制
為研究LPA對(duì)MSCs增殖的調(diào)節(jié)作用,用LPA處理MSCs,檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,并對(duì)其相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行分析,結(jié)果表明LPA促進(jìn)MSCs增殖,并呈濃度依賴性。LPA1/3受體特異性抑制劑,ERK信號(hào)通路抑制劑都不同程度降低
11、了LPA的促增殖作用。LPA使細(xì)胞內(nèi)c-myc蛋白表達(dá)上調(diào),而加入上述抑制劑則下調(diào)了c-myc蛋白的表達(dá)。因此,LPA能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖,這種作用是通過(guò)結(jié)合LPA1/3受體,活化ERK信號(hào)通路,從而上調(diào)c-myc蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
綜上所述,本研究確定了氧化應(yīng)激對(duì)MSCs促凋亡作用及其機(jī)制,分析了磷脂分子對(duì)MSCs旁分泌和增殖等生物學(xué)功能的調(diào)節(jié),為提高移植MSCs存活率,促進(jìn)磷脂分子在MSCs移植治療心血管疾病方面的應(yīng)
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