SDF-1-CXCR4信號通過ERK和PI3K-AKT信號通路上調(diào)survivin調(diào)節(jié)人骶骨軟骨肉瘤細胞周期和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化.pdf

1、目的和意義:軟骨肉瘤是是目前最常見的原發(fā)惡性腫瘤之一，嚴重影響人們的生活質(zhì)量，且早期診斷困難，治療方法單一。目前關(guān)于軟骨肉瘤，尤其是骶軟骨肉瘤的研究還十分匱乏，且主要集中在腫瘤的臨床分期及治療手段上，關(guān)于骶軟骨肉瘤的早期診斷，腫瘤的生物分子標記，發(fā)病機理以及腫瘤的靶向治療方面的研究還很少，而這些恰恰是從源頭上治愈腫瘤，杜絕腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)鍵問題。因此本研究將從分子角度入手，著重關(guān)注CXCR4和Survivin兩個分子在軟骨肉瘤細胞EMT以及

2、細胞周期調(diào)節(jié)中的作用，通過CXCR4和Survivin將腫瘤發(fā)生過程的重要信號通路，包括EMT、MEK/ERK和PI3K/AKT通路以及細胞周期調(diào)控有機地結(jié)合在一起，初步探討了兩者在骶軟骨肉瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中的作用，為骶軟骨肉瘤的早期診斷以及免疫治療提供了可能的靶點和新的可能的治療方法。
　　方法:隨機抽取來自2008年1月至2014年6月在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院和山東大學(xué)齊魯醫(yī)院就診的30位患者的病理組織材料。首先對所有樣品材料進

3、行切片和免疫組化，檢測指標為CXCR4和Survivin在所有樣品中的表達情況，包括蛋白在細胞內(nèi)的表達位置以及其表達強度，然后采用回顧分析的方法，將CXCR4和Survivin的表達情況與各個樣本的臨床特征進行對應(yīng)分析，從而得出CXCR4和Survivin的表達與各臨床特征之間的關(guān)系;隨后利用western blot和定量PCR分別檢測了不同濃度梯度和不同時間點SDF-1處理后，軟骨肉瘤細胞系SW1353細胞中Survivin蛋白質(zhì)和m

4、RNA的表達量的變化;使用激酶抑制劑分別阻斷SW1353細胞的MEK/ERK和PI3K/AKT通路，檢測SDF-1誘導(dǎo)的survivin蛋白表達水平的變化;接下來，我們利用survivin siRNA轉(zhuǎn)染SW1353細胞，來降低survivin的mRNA水平并進一步降低survivin的蛋白表達，利用流式細胞儀檢測survivin降低后對細胞周期進程的影響;最后，利用Western blot檢測20 ng/ml SDF-1處理后，對照組

5、和survivin siRNA轉(zhuǎn)染SW1353細胞中Snail和N-cadherin的表達水平。
　　結(jié)果:CXCR4蛋白主要在骶軟骨肉瘤細胞的細胞膜和細胞質(zhì)部分表達，Survivin蛋白主要定位于骶軟骨肉瘤細胞的細胞核和細胞質(zhì)中，兩者在亞細胞定位上具有一定的空間重疊。
　　30位患者及其各自的CXCR4和Survivin表達情況與臨床特征統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，Survivin蛋白的在骶軟骨肉瘤組織中的陽性表達率為87.6％(2

6、6/30)，CXCR4在骶軟骨肉瘤組織中的陽性表達率為83.3％(25/30)。另外，在高分化骶軟骨肉瘤患者中，CXCR4的陽性表達比例為73％，在重度骶軟骨肉瘤患者中，CXCR4的陽性表達比例為84％;同時，在輕度患者中，Survivin蛋白的陽性表達比例為73％，中重度患者為84％，CXCR4和Survivin蛋白表達情況高度一致。更重要的是，Western結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCR4和Survivin在重度骶軟骨肉瘤組織中的表達水平顯著高于

7、輕度組織，表明CXCR4和Survivin和骶軟骨肉瘤的嚴重程度密切相關(guān)。CXCR4和Survivin的表達與骶軟骨肉瘤的嚴重程度有關(guān)。在中重度骶軟骨肉瘤（Ⅱ，Ⅲ級）組織內(nèi)，CXCR4陽性比例為100％(16/16)，而在輕度組織內(nèi)，CXCR4陽性比例為64.3％(9/14)。正如預(yù)期的那樣，Survivin在中重度骶軟骨肉瘤（Ⅱ，Ⅲ級）和輕度（Ⅰ級）組織內(nèi)陽性表達比例分別為100％(16/16)和71.4％(10/14)。與輕度骶軟骨

8、肉瘤相比，中重度骶軟骨肉瘤組織的CXCR4和Survivin表達比例顯著升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。另外，我們也統(tǒng)計了CXCR4和Survivin與骶軟骨肉瘤復(fù)發(fā)之間的關(guān)系。在所有復(fù)發(fā)病例中，CXCR4和Survivin的陽性表達比例均為100％(15/15)。在未發(fā)生復(fù)發(fā)的病例中，CXCR4陽性表達比例為67％(10/15)，Survivin的陽性表達比例為73％(11/15)。統(tǒng)計結(jié)果顯示CXCR4(P=0.014)和Su

9、rvivin(P=0.032)的表達在復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)病例中所占比例有顯著差異，其與骶軟骨肉瘤復(fù)發(fā)之間直接相關(guān)。western blot結(jié)果顯示隨著SDF-1蛋白處理濃度的提高，由0升高到10，20ng/ml，Survivin蛋白的表達也隨之升高，但50ng/ml和20ng/ml SDF-1處理后Survivin表達量沒有顯著差異，表明當SDF-1達到20ng/ml時其對Survivin蛋白的誘導(dǎo)表達作用即達到飽和，所以除非另有說明，以后的

10、SDF-1體外處理濃度都選用20ng/ml。體外使用20ng/ml SDF-1處理SW1353細胞，分別在處理0，2，4，8，12，和36小時后取材進行Western檢測。結(jié)果表明，隨著處理時間的延長，0，2，4，8小時處理后，Survivin蛋白的表達量逐漸升高，但處理8，12，36小時后Survivin蛋白表達量沒有明顯變化，表明20ng/ml SDF-1處理8h后，其對Survivin蛋白的誘導(dǎo)作用即達到飽和。以上結(jié)果說明SDF-

11、1對Survivin的誘導(dǎo)作用是劑量和時間依賴性的。定量PCR顯示SDF-1誘導(dǎo)后Survivin mRNA也表現(xiàn)出類似的結(jié)果。在研究SDF-1對survivin的上調(diào)作用是否依賴于MEK/ERK和PI3K/AKT通路的試驗中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與DMSO處理對照組相比，U0126(P=0.024)和LY294002(P=0.0293)可以顯著降低SW1353細胞中SDF-1對survivin蛋白的誘導(dǎo)水平。這表明在體外細胞試驗中SDF-1對s

12、urvivin蛋白的誘導(dǎo)作用是依賴于MEK/ERK和PI3K/AKT途徑的。隨后構(gòu)建了survivinsiRNA轉(zhuǎn)染的SW1353細胞系，轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)的survivin蛋白水平顯著下降。與對照組相比，siRNA轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)survivin表達水平降低后，可以顯著抑制細胞周期蛋白D1及CDK2的表達，表明survivin可以影響細胞周期進程。我們進一步使用流式細胞術(shù)對對照組和轉(zhuǎn)染后細胞所處細胞周期比例進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與單獨使用SDF-1處

13、理和對照組相比，survivin siRNA顯著降低了SW1353細胞中S期細胞所占比例。處理24h后，與對照組的23.5％相比，survivin siRNA轉(zhuǎn)染組的S細胞只占總細胞數(shù)的6.2％(Df=2，x2=6.73，0.01＜P＜0.05)。為了確定SDF-1對survivin的誘導(dǎo)作用是否對EMT產(chǎn)生影響，我們檢測了20 ng/mlSDF-1處理后，對照組和survivin siRNA轉(zhuǎn)染SW1353細胞中Snail和N-cad

14、herin的表達水平。
　　結(jié)論:首先利用免疫組化的方法證明了CXCR4蛋白主要在骶軟骨肉瘤細胞的細胞膜和細胞質(zhì)部分表達，Survivin蛋白主要定位于骶軟骨肉瘤細胞的細胞核和細胞質(zhì)中，且CXCR4和Survivin蛋白在骶軟骨肉瘤組織細胞內(nèi)的陽性表達率很高，另外兩者的表達和骶軟骨肉瘤的嚴重程度，復(fù)發(fā)情況有非常顯著的對應(yīng)關(guān)系，與年齡、性別差異無關(guān)，因此CXCR4和Survivin蛋白的高表達有可能可以作為骶軟骨肉瘤的生物分子標記應(yīng)

15、用于骶軟骨肉瘤的早期檢測。western blot和定量PCR結(jié)果顯示隨著SDF-1蛋白處理濃度的提高和處理時間的延長，Survivin的蛋白和mRNA表達也隨之升高。表明Survivin的蛋白和mRNA水平都受到SDF-1/CXCR4的活性的影響。說明SDF-1/CXCR4在Survivin的上游發(fā)揮作用，由SDF-1/CXCR4激活的某些組分可以在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平對Survivin的表達水平進行調(diào)節(jié)，這就將SDF-1/CXCR4通路

16、和Survivin聯(lián)接到了一起，同時也證明了由SDF-1/CXCR4調(diào)控的腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移侵襲和由Survivin調(diào)控的細胞周期之間是相互聯(lián)系，相互影響的。MEK/ERK和PI3K/AKT通路抑制劑處理的實驗證明了MEK/ERK和PI3K/AKT參與了SDF-1/CXCR4對Survivin的調(diào)節(jié)作用。我們的研究還證明使用siRNA抑制SW1353細胞的Survivin表達后，可以顯著影響細胞的細胞周期，顯著減少SW1353細胞G2/M期

17、的比例。而同時Survivin siRNA轉(zhuǎn)染細胞顯著抑制了SDF-1誘導(dǎo)的Snail和N-cadherin的表達。而Snail和N-cadherin作為EMT的分子標記，其表達下降表明Survivin蛋白的缺失可以抑制軟骨肉瘤的EMT，即SDF-1/CXCR4誘導(dǎo)的細胞EMT是依賴于Survivin蛋白的。SDF-1/CXCR4與Survivin蛋白之間的相互作用表明EMT和細胞周期是一個相互影響的過程，兩個過程間可以互相協(xié)調(diào)，相互影