T淋巴細(xì)胞分泌的MIP-1α與人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞膜受體CCR5相互作用：Aβ依賴性促進(jìn)T淋巴細(xì)胞穿過血腦屏障.pdf

1、本文選擇6T-CEM細(xì)胞作為AD病人T淋巴細(xì)胞的模式細(xì)胞，著重探討了MIP-1α-CCR5相互作用在AD病人T淋巴細(xì)胞穿過血腦屏障過程中所發(fā)揮的生物學(xué)功能，同時(shí)通過建立Aβ腦內(nèi)沉積動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)注射至大鼠海馬的Aβ<,1-42>能夠誘導(dǎo)外周血T細(xì)胞MIP-1α依賴性進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，最后通過體外小膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)對(duì)T淋巴細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞之間的“交流”進(jìn)行了初步探討，為進(jìn)一步研究T淋巴細(xì)胞在AD病人腦內(nèi)發(fā)揮的作用以及對(duì)AD的治療提供了理論基礎(chǔ)。

2、 研究方法： 一、探討MIP-1α在T淋巴細(xì)胞(6T-CEM)穿過HBMEC單層過程中的作用。 1、細(xì)胞培養(yǎng)。 (1)HBMEC細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清，10％Nu血清的RPMI1640培養(yǎng)液。 (2)61-CEM細(xì)胞培養(yǎng)于10％新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。 2、免疫熒光技術(shù)檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)。 (1)6T-CEM以時(shí)間方式或rhMIP-1α以時(shí)間和濃度方式與H

3、BMEC共同孵育后，通過免疫熒光法觀察緊密連接蛋白ZO-1分布。 (2)6T-CEM、MIP-1α中和抗體與HBMEC共同孵育后檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1分布。 3、跨內(nèi)皮遷移實(shí)驗(yàn)分析6T-CEM穿過HBMEC單層能力及HBMEC單層通透性研究。 (1)6T-CEM與不同濃度的rhMIP-1α加入BBB體外模型Transwell上室作用20h后，計(jì)數(shù)穿過進(jìn)入Transwell下室的細(xì)胞數(shù)。 (2)6T-CE

4、M與不同濃度的MIP-1α中和抗體加入BBB體外模型Transwell上室作用20h后，計(jì)數(shù)穿過進(jìn)入Transwell下室的細(xì)胞數(shù)。 (3)Transwell上室中加入相同濃度rhMIP1-α，分別孵育不同時(shí)間，或者加入不同濃度的rhMIP-1α孵育6h，測(cè)定跨上皮細(xì)胞電阻(Trans Epithelial ElectricalResistance，TEER)，然后通過加入辣根過氧化物酶(HRP)進(jìn)行HRP flux分析。

5、 二、探討HBMEC膜受體CCR5在6T-CEM穿過HBMEC單層過程中的作用 1、應(yīng)用Western blot方法分析不同處理因素下HBMEC細(xì)胞膜上CCR5受體及ROCK激酶表達(dá) (1)6T-CEM與HBMEC分別孵育不同時(shí)間后，檢測(cè)HBMEC膜受體CCR5表達(dá)。 (2)rhMIP-1α以濃度和時(shí)間方式與HBMEC作用后，檢測(cè)HBMEC膜受體CCR5表達(dá)。 (3)rhMIP-1α與HBMEC分別孵育

6、不同時(shí)間后，或rhMIP-1α作用于分別經(jīng)過CCR5中和抗體2D7和ROCK特異性抑制劑Y27632處理的HBMEC后，檢測(cè)HBMEC中cofilin磷酸化情況。 (4)Aβ以濃度與時(shí)間方式與HBMEC作用后，檢測(cè)HBMEC膜受體CCR5表達(dá)。 2、真核表達(dá)載體構(gòu)建及穩(wěn)定細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法建立高表達(dá)CCR5的HBMEC細(xì)胞株 (1)重組質(zhì)粒pUCmT-CCR5的構(gòu)建 ①以CCR5的基因序列，依據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)

7、引物，PCR擴(kuò)增HBMEC中CCR5基因片斷。 ②T-A克隆將CCR5基因片段連接到pUCmT載體上，命名為pUCmT-CCR5。 ③將重組質(zhì)粒pUCmT-CCR5轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α，通過藍(lán)白篩選，酶切鑒定，驗(yàn)證插入片段的存在。 ④送交測(cè)序，驗(yàn)證插入片段序列的正確性。 (2)真核表達(dá)載體構(gòu)建 ①提取pUCmT-CCR5 (含有CCR5基因)和Invitrogen公司載體pcDNA3.1/Myc

8、-HisA質(zhì)粒DNA，將CCR5基因全長(1kb)定向克隆至pcDNA3.1/Myc-HisA，命名為pcDNA3.1/MH-CCR5。 ②雙酶切驗(yàn)證克隆是否成功，將pcDNA3.1/MH-CCR5送交測(cè)序，驗(yàn)證CCR5基因讀碼框的正確性。 ③利用Qiagen Midi rep質(zhì)粒DNA中量提取試劑盒，分別提取pcDNA3.1/Myc-HisA和peDNA3.1/MH-CCR5質(zhì)粒DNA。 (3)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBME

9、C細(xì)胞 ①利用Fugene<'TM>6 transfection reagent，對(duì)HBMEC進(jìn)行轉(zhuǎn)染，通過10-14天的G418篩選，挑取單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，形成能夠穩(wěn)定傳代的細(xì)胞克隆株。 ②利用CCR5的抗體，通過Western blot方法檢測(cè)CCR5蛋白的表達(dá)，以此來鑒定轉(zhuǎn)染成功的單克隆細(xì)胞株。 3、免疫熒光技術(shù)檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1表達(dá) 6T-CEM與CCR5中和抗體2D7預(yù)處理的HBMEC共同

10、孵育后檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1分布。 4、跨內(nèi)皮遷移實(shí)驗(yàn)分析6T-CEM穿過HBMEC單層能力 (1)6T-CEM細(xì)胞加入BBB體外模型已形成HBMEC(CCR5+)單層的Transwell上室作用20h后，計(jì)數(shù)穿過進(jìn)入Transwell下室的細(xì)胞數(shù)。 (2)6T-CEM細(xì)胞加入到經(jīng)CCR5中和抗體2D7預(yù)處理的BBB體外模型Transwell上室作用20h后，計(jì)數(shù)穿過進(jìn)入Transwell下室的細(xì)胞數(shù)。

11、 5、雙重免疫熒光技術(shù)觀察HBMEC膜受體CCR5和MIP-1α的定位 三、探討大鼠腦內(nèi)Aβ<,1-42>沉積對(duì)T細(xì)胞遷移入腦的影響 1、Aβ<,1-42>腦內(nèi)沉積動(dòng)物模型的建立及標(biāo)本采集與處理。 (1)制備聚集態(tài)Aβ<,1-42>和Aβ<,42-1>，通過立體定位儀將Aβ<,1-42>注射到Wistar大鼠雙側(cè)海馬，對(duì)照組注射等體積Aβ<,42-1>和PBS。 (2)標(biāo)本采集與處理。 ①心臟采血

12、，肝素抗凝。 ②經(jīng)左心室依次灌注生理鹽水和4％多聚甲醛，立即取腦。 ③腦組織經(jīng)后固定和蔗糖溶液浸泡，冰凍切片機(jī)上行冠狀切片，片厚10μm。 ④通過NycoPrep<'TM> 1.077 A and MagCellect Rat CD3+T細(xì)胞分離試劑按照產(chǎn)品說明書操作規(guī)程從肝素化的大鼠全血中分離T淋巴細(xì)胞。 ⑤Trizol提取大鼠T細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。 2、雙重免疫熒光技術(shù)觀察Aβ<,

13、1-42>沉積對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞膜受體CCR5表達(dá)及T細(xì)胞穿過血腦屏障的影響。 (1)利用vwF和CCR5的抗體，通過雙重免疫熒光技術(shù)觀察腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞膜受體CCR5表達(dá)。 (2)利用CD3抗體，通過免疫熒光技術(shù)觀察腦內(nèi)T細(xì)胞分布。 (3)大鼠腹腔注射MIP-1α的中和抗體，觀察阻斷MIP-1α的效應(yīng)對(duì)T細(xì)胞穿過血腦屏障的影響。 3、半定量PCR方法檢測(cè)Ap<,1-42>腦內(nèi)沉積大鼠T淋巴細(xì)胞MIP-1

14、α表達(dá)情況。 研究結(jié)果： 1、T淋巴細(xì)胞分泌的MIP-1β促使其穿過HBMEC單層能力增強(qiáng)(1)表達(dá)MIP-1β的T淋巴細(xì)胞(6T-CEM細(xì)胞)或rhMIP-1α與HBMEC相互作用后，引起HBMEC間的緊密連接結(jié)構(gòu)紊亂。 (2)rhMIP-1α能夠促使6T-CEM穿過HBMEC單層能力增強(qiáng)，而經(jīng)過MIP-1α中和抗體處理或針對(duì)MIP-1αsiRNA干擾后的6T-CEM穿過HBMEC單層能力降低，同時(shí)緊密連接結(jié)構(gòu)

15、基本保持完整。 2、HBMEC膜受體CCR5介導(dǎo)了T淋巴細(xì)胞穿過HBMEC單層過程。 (1)6T-CEM或rhMIP-1α與HBMEC相互作用，均引起HBMEC膜受體CCR5表達(dá)升高。 (2)成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1/Myc-HisA-CCR5及穩(wěn)定表達(dá)CCR5基因的HBMEC細(xì)胞克隆株。 (3)6T-CEM穿過高表達(dá)CCR5的HBMEC單層能力增強(qiáng)，而加入CCR5中和抗體2D7后，6T-CE

16、M穿過HBMEC單層能力降低，并且緊密連接結(jié)構(gòu)基本保持完整。 (4)rhMIP-1α能夠與HBMEC細(xì)胞膜上的CCR5配體．受體共定位。 (5)MIP-1α-CCR5相互作用通過ROCK信號(hào)途徑引起緊密連接紊亂。 3、大鼠腦內(nèi)Aβ<,1-42>沉積誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞MIP-1α依賴性遷移入腦。 (1)Aβ<,1-42>能夠上調(diào)HBMEC細(xì)胞膜上CCR5受體表達(dá)。 (2)成功制備Aβ<,1-42>在腦內(nèi)

17、沉積的動(dòng)物模型。 (3)并且在腦內(nèi)沉積的模型動(dòng)物中Aβ<,1-42>沉積也能夠誘導(dǎo)外周血T淋巴細(xì)胞MIP-1α和腦內(nèi)皮細(xì)胞上CCR5表達(dá)升高，最終引起外周血T細(xì)胞MIP-1α依賴性穿過血腦屏障。 研究結(jié)論： 1、T淋巴細(xì)胞分泌的MIP-1α與HBMEC細(xì)胞膜上的CCR5受體相互作用，通過激活HBMEC細(xì)胞中ROCK信號(hào)通路引起緊密連接結(jié)構(gòu)紊亂，導(dǎo)致緊密連接開放，使T淋巴細(xì)胞穿過HBMEC單層能力增強(qiáng)。 2