eNOS-F92a-Caveolin-1基因的慢病毒載體構(gòu)建及功能分析.pdf

1、背景及目的：
　　肺動脈高壓(Pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種與多種病因有關(guān)的進展性疾病，其病理基礎(chǔ)是肺動脈壁的內(nèi)皮或結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，致使肺血管內(nèi)皮功能紊亂及肺血管重構(gòu)。因此，有效解決內(nèi)皮功能紊亂及盡早阻止并逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)、擴大血管床橫截面積才可能從根本上解決PAH。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)是調(diào)控血管張力和通透性的

2、重要分子，主要存在于內(nèi)皮細胞中，是血管壁上一氧化氮(NO)的主要來源，血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的NO可通過多途徑發(fā)揮抗PAH的作用。而位于胞膜窖(Caveolae)的窖蛋白-1(Caveolin-1)是調(diào)節(jié)eNOS的關(guān)鍵性負性調(diào)控因子。主要是位于Caveolin-1的92位苯丙氨酸與eNOS結(jié)合而發(fā)揮抑制效應，而用丙氨酸(F92A)代替92位苯丙氨酸后獲得的突變型F92A-Caveolin-1（F92A-Cav-1、Caveolin-1 mut

3、）不具有抑制eNOS的作用。因此，通過改變基因Caveolin-1對eNOS的負調(diào)控作用，可增加eNOS的活性，促進內(nèi)皮細胞對NO的分泌，從而有利于PAH的治療。
　　本研究旨在構(gòu)建攜帶eNOS和F92A-Caveolin-1目的基因的慢病毒載體，并對其功能進行檢測分析，為下一步的實驗研究奠定科研基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1)根據(jù)質(zhì)粒(eNOS、F92A-Cav-1)分別設(shè)計引物，并分別在5'端和3'端加入相應的酶切位點

4、，與慢病毒載體骨架(pLVX-mCMV-mCherry)的酶切位點相同。采用Polymerase chain reaction(PCR)擴增eNOS及F92A-Cav-1目的片段;通過酶切、連接、轉(zhuǎn)化、挑取克隆并篩選陽性克隆，通過PCR鑒定、測序及酶切鑒定等步驟，鑒定正確的陽性克隆質(zhì)粒命名為: pLVX-eNO S-P2A-F92-Caveolin-1-mCMV-mCherry(LV-eNOS/F92-Cav-1)。2)利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法

5、(Lipofectamine2000)，使用人胚腎細胞（293-T細胞）進行包裝，可獲得慢病毒Lenti-eNOS/F92-Cav-1，收集感染后48小時及72小時的病毒上清液，采用PEG-it濃縮病毒，采用稀釋法測定病毒滴度，并測定293-T細胞的感染指數(shù)(multiplicity of infection，MOI)。3)以MOI=1的慢病毒顆粒Lenti-eNOS/F92-Cav-1感染293-T細胞，熒光顯微鏡下檢測感染陽性率。4

6、）鑒定質(zhì)粒功能，將293-T細胞分三組:①實驗組:慢病毒顆粒(Lenti-eNOS/F92-Cav-1)感染組;②陰性對照組:空載體(pLVX-mCMV-mCherry)感染組;③空白對照組(Control組)。實驗組按MOI=1感染293-T細胞，應用細胞免疫熒光化學方法檢測eNOS蛋白（表達綠色熒光）表達水平，再以DAF-FM DA方法（NO熒光探針法）檢測NO生成量。
　　結(jié)果：
　　1.通過陽性克隆PCR鑒定，測序及

7、酶切鑒定，提示慢病毒表達質(zhì)粒LV-eNOS/F92-Cav-1構(gòu)建成功。
　　2.病毒滴度為2×108TU/ml，慢病毒感染293-T感染指數(shù)(MOI)值為1。
　　3.按MOI=1感染293-T細胞陽性率可達80％以上。
　　4.與陰性對照組及Control組相比，實驗組eNOS蛋白表達水平及NO生成量均升高。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建了攜帶目的基因eNOS/F92A-Caveolin-1的慢病毒載體