Wnt-Ca2+信號途徑在黑素瘤發(fā)展過程中作用的初步研究.pdf

1、皮膚黑素瘤是一種高惡性、發(fā)展快、易轉(zhuǎn)移、預后差的惡性腫瘤，然而，目前還缺少能確定黑素瘤是否具有高侵襲性的特異性標志。Wnt信號通路是近年來備受關注的一條調(diào)控胚胎發(fā)育和腫瘤形成的信號轉(zhuǎn)導途徑，目前認為，Wnt信號通路包括經(jīng)典Wnt/β-catenin途徑和非經(jīng)的Wnt/Ca2+途徑及Wnt/JNK途徑，已有的文獻資料及我們的前期研究結果顯示，經(jīng)典Wnt/β-catenin通路在惡性黑素瘤中被激活，可能在黑素瘤的發(fā)生過程中具有重要作用。但是

2、目前對于非經(jīng)典Wnt/Ca2+通路在黑素瘤發(fā)生和發(fā)展過程中的激活狀態(tài)的動態(tài)變化及其功能意義并不明確。因此，本課題以來自不同生長階段的六種黑素瘤細胞系為標本，采用RT-PCR法檢測Wnt/Ca2+信號途徑激活的關鍵配體Wnt5a和Wnt11的基因表達水平；運用鈣離子成像的方法，結合藥理學實驗，檢測卡巴膽堿對上述細胞鈣離子穩(wěn)態(tài)的影響及蛋白激酶C的調(diào)節(jié)作用，進一步揭示該信號途徑在黑素瘤發(fā)展過程中的功能意義。
　　第一部分，正常黑素細胞和

3、六種黑素瘤細胞的形態(tài)特征及侵襲能力比較
　　細胞形態(tài)學顯示：培養(yǎng)的正常黑素細胞和黑素瘤細胞在生長方式和細胞形態(tài)上均有顯著的不同。培養(yǎng)的表皮黑素細胞呈現(xiàn)規(guī)則的渦旋狀生長方式，細胞形態(tài)為纖細的雙極紡錘狀，細胞核清晰，黑素顆粒少見。淺表擴散型惡性黑素瘤（primary superficial spreading situation）（WM793B細胞株）形態(tài)多為雙極紡錘狀，黑素顆粒較多；結節(jié)性惡性黑素瘤（nodular melanoma

4、 situation）（451Lu細胞株）形態(tài)為樹枝狀；來自黑素瘤腋窩淋巴結轉(zhuǎn)移的SK-MEL-5細胞株形態(tài)為短紡錘狀，并有局部聚集生長的傾向；來自黑素瘤淋巴結轉(zhuǎn)移（lymph node metastases）、具有高侵襲特性的A2058細胞呈局部聚集生長，形態(tài)主要為紡錘狀；Libr細胞和A-375細胞也呈現(xiàn)紡錘狀。劃痕試驗結果顯示：來自黑素瘤淋巴結轉(zhuǎn)移階段的A2058細胞和SK-MEL-5細胞具有較強的侵襲能力，可以在12小時和24小

5、時侵入劃痕區(qū)域；結節(jié)性惡性黑素瘤451Lu細胞在48小時開始侵入劃痕區(qū)域，而淺表擴散型惡性黑素瘤WM793B細胞在48小時內(nèi)未見明顯的變化。結果提示：與正常的黑素細胞相比，六種黑素瘤細胞均呈現(xiàn)出典型的腫瘤細胞特性，即細胞膜、細胞核的形態(tài)異質(zhì)性以及生長方式的不規(guī)則性，并且隨著黑素瘤由淺表擴散至淋巴結轉(zhuǎn)移的不同發(fā)展階段，腫瘤細胞的侵襲能力逐漸增強。
　　第二部分，不同生長階段黑素瘤中Wnt5A和Wnt11基因表達的動態(tài)變化及其意義

6、r>　　運用RT-PCR法，檢測正常黑素細胞和六種來自不同生長階段的皮膚黑素瘤細胞（包括WM793B、451Lu、SK-MEL-5、A2058、Libr和A-375）中Wnt5A和Wnt11基因表達水平。結果表明：在正常黑素細胞和不同的黑素瘤細胞中，Wnt5A和Wnt11基因的表達均表現(xiàn)出動態(tài)變化的特征，并且二者的變化是一致的。Wnt5A和Wnt11水平在正常黑素細胞中表達很低，而在黑素瘤有不同程度的升高。另外，分別來自于淺表擴散型惡性

7、黑素瘤、結節(jié)性惡性黑素瘤和淋巴結轉(zhuǎn)移階段的WM793B、451Lu和A2058細胞系中，Wnt5A和Wnt11基因表達水平逐漸下降，甚至在A2058細胞系中，兩種基因的表達均低于正常黑素細胞。結果提示：在黑素瘤的不同發(fā)展階段，Wnt5A和Wnt11基因表達的動態(tài)變化使非經(jīng)典的Wnt/Ca2+通路激活程度不同，從而影響腫瘤的侵襲能力。
　　第三部分，卡巴膽堿對不同生長階段的黑素瘤細胞中鈣離子穩(wěn)態(tài)的影響及蛋白激酶C的調(diào)節(jié)作用
　

8、　鈣離子成像的結果顯示：正常黑素細胞對卡巴膽堿（1mM）無明顯反應，而WM793B、451Lu、SK-MEL-5、A2058、Libr和A-375細胞對卡巴膽堿（1mM）誘發(fā)的細胞內(nèi)鈣離子濃度變化反應均有不同程度的升高，其中以來自淋巴結轉(zhuǎn)移的A2058細胞最為顯著。提前給予蛋白激酶C的激動劑phorbol12,13-dibutyrate(PDBu,2μM)對上述卡巴膽堿誘發(fā)的胞內(nèi)鈣離子濃度變化具有不同的抑制作用。結果提示：在黑素瘤發(fā)展過

9、程中，介導卡巴膽堿誘發(fā)鈣離子穩(wěn)態(tài)變化的毒蕈堿樣膽堿能受體在表型或功能上是動態(tài)變化的，蛋白激酶C參與該受體功能的調(diào)節(jié)。在來自淋巴結轉(zhuǎn)移階段的A2058細胞系中，Wnt5A和Wnt11基因表達很低，卡巴膽堿誘發(fā)的細胞鈣離子穩(wěn)態(tài)的反應卻顯著高于其他檢測細胞，該結果提示：Wnt/Ca2+信號通路的下游信號分子——細胞內(nèi)蛋白激酶C的激活可以抑制卡巴膽堿誘發(fā)的鈣離子穩(wěn)態(tài)的變化，進一步證實了蛋白激酶C的負性調(diào)節(jié)作用。
　　結論：1.實驗所用WM

10、793B、451Lu、SK-MEL-5、A2058、Libr和A-375黑素瘤細胞分別來自腫瘤的不同發(fā)展階段。形態(tài)學試驗和侵襲能力檢測結果提示：六種黑素瘤細胞均呈現(xiàn)出典型的腫瘤細胞特性，即細胞膜、細胞核的形態(tài)異質(zhì)性以及生長方式的不規(guī)則性，并且隨著黑素瘤由淺表擴散至淋巴結轉(zhuǎn)移的不同發(fā)展階段，腫瘤細胞的侵襲能力逐漸增強。運用這些腫瘤細胞株可以模擬黑素瘤動態(tài)發(fā)展的過程。2.在黑素瘤的不同發(fā)展過程中，Wnt5A和Wnt11基因的表達均表現(xiàn)出動態(tài)

11、變化的特征，并且二者的變化是一致的。分別來自于淺表擴散型惡性黑素瘤、結節(jié)性惡性黑素瘤和淋巴結轉(zhuǎn)移階段的WM793B、451Lu和A2058細胞系中，Wnt5A和Wnt11基因表達水平有逐漸下降的趨勢，甚至在A2058細胞系中，兩種基因的表達均低于正常黑素細胞。結果提示：在黑素瘤的不同發(fā)展階段，Wnt5A和Wnt11基因表達的動態(tài)變化使非經(jīng)典的Wnt/Ca2+通路激活程度不同，從而影響腫瘤的侵襲能力。3.與正常黑素細胞相比，卡巴膽堿對不同