Wnt5a-Ca2+-Calcineurin-NFAT通路信號分子在黑素瘤中的表達.pdf

1、惡性黑素瘤（MM）是致死率最高的皮膚腫瘤，此腫瘤特點是惡性程度高、易于轉(zhuǎn)移、預(yù)后較差、死亡率較高，五年生存率低于11％。目前的治療方法仍不令人滿意，尤其是轉(zhuǎn)移性黑素瘤。至今尚不完全清楚惡性黑素瘤發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的機理，如果能揭示某些與惡性黑素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)的重要因素，尤其是闡明參與黑素瘤細胞移動、浸潤能力調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將對侵襲性黑素瘤的分子識別及靶向治療非常重要。文獻報道在人體腫瘤細胞的移動、增殖及浸潤中Ca2+發(fā)揮積極調(diào)控作用

2、，在腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移中Ca2+介導(dǎo)的信號也是一個重要的節(jié)點，有關(guān)Wnt/Ca2+信號通路與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系已成為研究者關(guān)注的熱點，但其確切的調(diào)控機理仍不是特別清楚?；罨疶細胞核因子（NuclearfactorofactivatedT-cells，NFAT）最早發(fā)現(xiàn)于T細胞內(nèi)，是一種Ca2+依賴的的轉(zhuǎn)錄因子，大量研究認為它和人體多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。根據(jù)目前的研究結(jié)果，結(jié)合我們實驗組的前期研究，我們認為，在一些腫瘤細胞中存

3、在一條Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT信號通路，這條信號通路可能在黑素瘤中被激活，并參與了黑素瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程。如果能通過實驗證實這條信號通路的存在，并明確其作用及調(diào)控機理，將為闡明惡性黑素瘤的發(fā)病機理起到重要作用，并為黑素瘤患者的靶向治療提供重要的理論依據(jù)。為此，我們首先分離、培養(yǎng)正常皮膚黑素細胞及來源于不同生長期的三株黑素瘤細胞系，采用RT-PCR法和Western-blot法檢測Wnt5a/Ca2+/Cal

4、cineurin/NFAT信號通路中主要的信號分子Wnt5a、DVL（散亂蛋白）、Calcineurin(鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶)、NFAT2、COX-2(環(huán)氧合酶2)、VEGF（血管內(nèi)皮生長因子）、Vinculin（紐帶蛋白）、Vimentin（波形蛋白）的表達水平，再用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測這四株細胞內(nèi)的Ca2+濃度，最后用免疫組化檢測色素痣（良性黑素細胞腫瘤）及原位、侵襲性和轉(zhuǎn)移性黑素瘤的臨床組織標本中NFAT2和Calcineurin

5、-B的表達。目的是證實Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT信號通路在不同發(fā)展期黑素瘤細胞中的激活狀態(tài)。
　　實驗一Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT通路信號分子在正常黑素細胞和不同生長期黑素瘤細胞中的表達
　　采用RT-PCR和Western-blot方法，檢測了皮膚正常黑素細胞和分別來源于原位、侵襲性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的WM793B、LIBR和SK-MEL-5惡性黑素瘤細胞系中Wnt5a、D

6、VL2、Calcineurin、NFAT2、COX-2、VEGF-A、Vinculin及Vimentin八個信號分子的表達。結(jié)果顯示：Wnt5a、DVL2、Calcineurin、NFAT2及COX-2等八個分子在皮膚正常黑素細胞中表達較弱，而在其它3株不同生長期黑素瘤細胞中均有不同程度的高表達，表達強度在各株黑素瘤細胞之間有一些差異，但在不同生長期惡性黑素瘤細胞中并未呈現(xiàn)動態(tài)的變化趨勢。我們認為，Wnt5a/Ca2+/Calcineu

7、rin/NFAT信號通路在黑素瘤細胞中被激活，可能參與了惡性黑素瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過程。
　　實驗二激光共聚焦掃描顯微鏡檢測正常黑素細胞和不同生長期黑素瘤細胞中的Ca2+濃度
　　本實驗運用激光共聚焦掃描顯微鏡檢技術(shù)，檢測了皮膚正常黑素細胞和分別來源于原位、侵襲性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的WM793B、LIBR、SK-MEL-5惡性黑素瘤細胞系中的Ca2+濃度。結(jié)果顯示：在皮膚正常黑素細胞中Ca2+濃度較低，而在其它3株不同生長期黑素

8、瘤細胞中Ca2+濃度均有不同程度的升高，熒光強度在各株黑素瘤細胞之間有一定差異，但在不同生長期惡性黑素瘤細胞中并未呈現(xiàn)動態(tài)的變化趨勢。黑素瘤細胞中Ca2+濃度的增高提示Ca2+的濃度變化可能參與了黑素瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移過程，可能在Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT信號通路調(diào)控黑素瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有關(guān)鍵作用。
　　實驗三免疫組化檢測NFAT和Calcineurin在色素痣及原位、侵襲性和轉(zhuǎn)移性黑素瘤組織標本中的

9、表達
　　本實驗采用免疫組織化學(xué)染色方法，檢測了色素痣標本（30例）以及原位、侵襲性和轉(zhuǎn)移性黑素瘤組織標本（各10例）中NFAT2和Calcineurin-B的表達。結(jié)果顯示：NFAT2蛋白主要表達于胞漿及胞核，而Calcineurin-B主要表達于胞漿。在30例色素痣中兩種信號分子的表達皆為陰性，而NFAT2在原位（2例）、侵襲性（8例）和轉(zhuǎn)移性(9例)黑素瘤臨床組織標本中呈陽性表達，其在黑素瘤臨床組織標本中的陽性表達率為63％

10、，與色素痣的陰性表達具有顯著差異（P<0.001）。在侵襲性和轉(zhuǎn)移性黑素瘤臨床標本中強陽性表達分別為6例及7例，而原位黑素瘤中無1例為強陽性表達，提示隨著腫瘤的發(fā)展，其表達有逐漸增強的趨勢。Calcineurin-B在色素痣細胞中均為陰性表達，而在原位（3例）、侵襲性（8例）和轉(zhuǎn)移性（9例）黑素瘤臨床組織標本中呈陽性表達，陽性表達率在色素痣和黑素瘤之間差異顯著（P<0.001）。在侵襲性和轉(zhuǎn)移性黑素瘤臨床標本中強陽性表達分別為6例及7例

11、，而原位黑素瘤中也無1例為強陽性表達，其陽性表達率及表達強度與NFAT2一致，提示這兩種分子在不同發(fā)展階段的黑素瘤組織標本中的表達具有動態(tài)變化過程，Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT信號通路可能在黑素瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用。
　　綜上所述，在分別來源于原位、侵襲性和轉(zhuǎn)移性黑素瘤細胞系中Wnt5a、DVL2、Calcineurin、NFAT2、COX-2、VEGF-A、Vinculin和Vimen

12、tin在mRNA和蛋白水平的表達均增高，但并不呈現(xiàn)動態(tài)的變化趨勢，而正常黑素細胞僅有低表達；黑素瘤細胞內(nèi)Ca2+濃度也較正常黑素細胞明顯增高，黑素瘤組織標本中NFAT2和Calcineurin-B的表達明顯增強，且呈現(xiàn)出在侵襲性和轉(zhuǎn)移性黑素瘤較原位黑素瘤表達更強的趨勢，而且這兩個分子的陽性表達率和表達強度具有一致性，提示W(wǎng)nt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT信號通路在黑素瘤中被激活，可能在黑素瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移中具有重要作用