缺氧微環(huán)境下AEG-1調(diào)控肝細(xì)胞癌多藥耐藥的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC，以下簡(jiǎn)稱肝癌）是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。多藥耐藥使肝癌患者的術(shù)后化療效果十分有限，這一直是遏制肝癌預(yù)后改善的關(guān)鍵問(wèn)題。肝癌作為實(shí)體腫瘤，缺氧是肝癌細(xì)胞生存的真實(shí)微環(huán)境，而缺氧也是導(dǎo)致肝癌多藥耐藥的因素之一。因此，深入研究缺氧微環(huán)境下肝癌多藥耐藥的機(jī)制并積極探索有效的逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的治療手段，對(duì)于進(jìn)一步改善肝癌患者的治療效果及生存率具有極其重要的意義。
　　近年來(lái)

2、星形膠質(zhì)細(xì)胞提升基因-1(astrocyte elevated gene-1，AEG-1)在腫瘤多藥耐藥中的作用逐漸引起人們的關(guān)注。AEG-1是新發(fā)現(xiàn)的癌基因，位于與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)的人類8號(hào)染色體(8q22)上，研究表明其是促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵因子。AEG-1是可以通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt、NF-κB等多條信號(hào)途徑參與正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化，腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，血管生成等腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)，并能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬活性和化

3、療耐藥。有研究認(rèn)為，AEG-1可能是通過(guò)某些信號(hào)通路的調(diào)控來(lái)影響多藥耐藥基因-1(multidrug resistance gene1，MDR1)的表達(dá)，從而參與介導(dǎo)腫瘤多藥耐藥，但其具體作用機(jī)制目前尚不清楚。
　　本課題首先在肝癌組織、癌旁肝組織及正常肝組織標(biāo)本中檢測(cè)AEG-1、MDR1的表達(dá)情況。然后研究在缺氧微環(huán)境下AEG-1的表達(dá)情況及其對(duì)MDR1表達(dá)、肝癌細(xì)胞系HepG2多藥耐藥性的影響;進(jìn)而通過(guò)RNA干擾技術(shù)，在缺氧微

4、環(huán)境下特異性抑制肝癌細(xì)胞系HepG2中AEG-1的表達(dá)水平，并綜合利用一系列分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的方法研究AEG-1調(diào)控肝細(xì)胞癌多藥耐藥的可能分子機(jī)制。
　　第一章 AEG-1、MDR1在正常肝組織、癌旁肝組織及肝癌中的表達(dá)情況
　　目的：了解AEG-1在正常肝組織、癌旁肝組織及肝癌組織中表達(dá)情況及其與MDR1表達(dá)的相關(guān)性
　　方法：
　　(1)免疫組化檢測(cè)30例肝癌組織、30例癌旁肝組織及8例正常肝組織中AE

5、G-1、MDR1蛋白的表達(dá)情況。
　　(2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)方法檢測(cè)AEG-1、MDR1mRNA在30例新鮮肝癌組織及其配對(duì)的癌旁肝組織中的表達(dá)水平，8例新鮮正常肝組織作為對(duì)照。
　　結(jié)果：
　　(1)免疫組化法檢測(cè)結(jié)果顯示，肝癌組織中的AEG-1、MDR1蛋白陽(yáng)性表達(dá)明顯高于癌旁肝組織和正常肝組織(P＜0.01)。而在癌旁肝組織和正常肝組織之間，兩者陽(yáng)性表達(dá)情況無(wú)顯著性差異。
　　(2) q

6、RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，肝癌新鮮組織中AEG-1、MDR1mRNA表達(dá)水平均明顯高于癌旁肝組織和正常肝組織，差異均具有顯著性(P＜0.01)。而癌旁肝組織和正常肝組織之間，AEG-1、MDR1mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(3)根據(jù)免疫組化結(jié)果對(duì)AEG-1、MDR1兩者之間相關(guān)性研究得出r=0.725，P＜0.05;而根據(jù)qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析得出r=0.758，P＜0.01。
　　結(jié)論：
　

7、　AEG-1、MDR1基因在肝癌組織中高表達(dá);而在癌旁肝組織和正常肝組織中均呈低表達(dá)。肝癌組織中AEG-1和MDR1的表達(dá)之間存在相關(guān)性，提示AEG-1對(duì)MDR1的表達(dá)存在調(diào)控關(guān)系。
　　第二章 缺氧微環(huán)境下AEG-1表達(dá)對(duì)HepG2多藥耐藥的影響
　　目的: 探討缺氧微環(huán)境下AEG-1的表達(dá)及其對(duì)HepG2多藥耐藥的影響
　　方法:
　　(1)常氧下HepG2作為對(duì)照組（A組）;以100μmol/L的COCl2

8、作用于肝癌細(xì)胞HepG2構(gòu)建細(xì)胞缺氧模型作為實(shí)驗(yàn)組（B組）;常氧下正常肝細(xì)胞L02作為正常對(duì)照組（C組）。
　　(2) qRT-PCR、Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞中AEG-1、MDR1mRNA和蛋白在0h、24h、48h表達(dá)量。
　　(3) MTT法檢測(cè)ADM、5-Fu、DDP在A、B兩組細(xì)胞中的48hIC50
　　結(jié)果:
　　(1) qRT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示，A組HepG2肝癌細(xì)胞株中的

9、 AEG-1、MDR1 mRNA表達(dá)量明顯高于C組L02細(xì)胞株(P＜0.01);B組HepG2肝癌細(xì)胞株中的AEG-1、MDR1 mRNA表達(dá)量明顯高于A組HepG2肝癌細(xì)胞株(P＜0.01)。
　　(2) Western blotting方法檢測(cè)結(jié)果顯示，A組HepG2肝癌細(xì)胞株中的AEG-1、MDR1蛋白表達(dá)量明顯高于C組L02細(xì)胞株(P＜0.01);B組HepG2肝癌細(xì)胞株中的AEG-1、MDR1蛋白表達(dá)量明顯高于A組Hep

10、G2肝癌細(xì)胞株(P＜0.01)。
　　(3) MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，B組ADM、5-Fu、DDP在HepG2中的48h IC50與A組比有明顯的升高，分別為A組的2.02倍(P＜0.01)，1.53倍（P＜0.01），1.90倍（P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　缺氧微環(huán)境下AEG-1、MDR1在肝癌HepG2細(xì)胞株中呈高表達(dá)，高表達(dá)的AEG-1可能通過(guò)上調(diào)MDR1的表達(dá)，參與介導(dǎo)了腫瘤的多藥耐藥。
　　第三章

11、AEG-1基因RNAi質(zhì)粒載體的構(gòu)建、鑒定與篩選
　　目的:構(gòu)建AEG-1基因RNAi質(zhì)粒載體，篩選出陽(yáng)性干擾質(zhì)粒及陰性干擾對(duì)照質(zhì)粒
　　方法:
　　(1)設(shè)計(jì)靶序列并合成shRNA，構(gòu)建干擾質(zhì)粒載體 pGPU6-AEG-1-shRNA。其中pGPU6-AEG-1-shRNA-NC為陰性干擾質(zhì)粒，pGPU6-AEG-1-shRNA-746、pGPU6-AEG-1-shRNA-1490、pGPU6-AEG-1-shRNA

12、-1576為陽(yáng)性干擾質(zhì)粒。
　　(2)酶切、測(cè)序鑒定質(zhì)粒載體。
　　(3) Lip2000介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，缺氧下培養(yǎng)48h。
　　(4)檢測(cè)轉(zhuǎn)染率。分為四組:A組AEG-1-shRNA-NC;B組AEG-1-shRNA-746; C組AEG-1-shRNA-1490; D組AEG-1-shRNA-1576。
　　(5) qRT-PCR、Western blotting檢測(cè)各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞株中

13、AEG-1 mRNA和蛋白表達(dá)量。分為五組:A組HepG2+CoCl2;B組HepG2+CoCl2+shRNA-NC;C組HepG2+CoCl2+shRNA-746;D組HepG2+CoCl2+shRNA-1490;E組HepG2+CoCl2+shRNA-1576。
　　結(jié)果:
　　(1)經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定，成功構(gòu)建干擾質(zhì)粒載體。
　　(2)檢測(cè)各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞株轉(zhuǎn)染率，均達(dá)到75％左右，且各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)

14、意義。
　　(3) qRT-PCR、Western blotting方法檢測(cè)結(jié)果顯示，C組HepG2肝癌細(xì)胞株中的AEG-1 mRNA和蛋白表達(dá)量較其他各組中要低，差異具有顯著性(P＜0.01)，而B(niǎo)組細(xì)胞中AEG-1 mRNA和蛋白表達(dá)量與A組無(wú)明顯差別，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建pGPU6-AEG-1-shRNA質(zhì)粒載體。
　　2.對(duì)靶基因AEG-1干擾效果較好的是pGPU6-AEG-1

15、-shRNA-746質(zhì)粒載體;而pGPU6-AEG-1-shRNA-NC對(duì)HepG2細(xì)胞中AEG-1的表達(dá)幾無(wú)影響。
　　第四章缺氧微環(huán)境下RNAi抑制AEG-1表達(dá)對(duì)HepG2多藥耐藥的影響
　　目的:探討缺氧微環(huán)境下RNAi抑制AEG-1表達(dá)對(duì)HepG2多藥耐藥的影響
　　方法:
　　(2)有效干擾質(zhì)粒pGPU6AEG-1RNAi+和無(wú)效對(duì)照組質(zhì)粒pGPU6AEG1RNAi-轉(zhuǎn)染HepG2肝癌細(xì)胞。
　

16、　(2)分為空白對(duì)照組(A組:HepG2+CoCl2)、陰性干擾組(B組:HepG2AEG-1-RNAi-+COCl2)、陽(yáng)性干擾組(C組:HepG2AEG-1-RNAi++COCl2)
　　(3) qRT-PCR、Western blotting檢測(cè)各組肝癌HepG2細(xì)胞株中AEG-1、MDR1 mRNA和蛋白0h、24h、48h表達(dá)量。
　　(4) MTT法檢測(cè)ADM、5-Fu、DDP在各組細(xì)胞中的48h IC50。

17、r>　　結(jié)果:
　　(1) qRT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示，C組HepG2肝癌細(xì)胞株中的AEG-1、MDR1 mRNA表達(dá)量明顯低于A、B組中的表達(dá)，差異有顯著性(P＜0.01);A、B兩組中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(2) Westem blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，C組HepG2肝癌細(xì)胞株中的AEG-1、MDR1 mRNA表達(dá)量明顯低于A、B組中的表達(dá)，差異有顯著性（P＜0.01）;A、B兩組中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

18、。
　　(3) MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，缺氧微環(huán)境下ADM、5-Fu、DDP在C組HepG2中的48h IC50和A組比較有明顯的降低，分別為A組的0.59倍(P＜0.01)，0.69倍(P＜0.01)，0.66倍(P＜0.01)。A、B兩組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　(1)缺氧微環(huán)境下特異性抑制HepG2中AEG-1的表達(dá)，可顯著下調(diào)MDR1的表達(dá)，提示AEG-1作為MDR1的上游基因，可以上調(diào)MDR1的表達(dá)。