Tspan1、Tspan8在胰腺癌中的表達(dá)及其功能研究.pdf

1、前言
　　胰腺癌是腫瘤相關(guān)性疾病中死亡率最高的癌腫之一，胰腺癌患者預(yù)后差，國(guó)內(nèi)外多個(gè)醫(yī)療中心統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，1年生存率在20％以下，5年生存率低于5％。低生存率原因在于80％以上的病人在確診時(shí)已經(jīng)廣泛轉(zhuǎn)移，大部分病人死于癌腫轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)。胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)是胰腺癌中最常見的病理類型，約占胰腺癌的80％-90％。胰腺癌的惡性行為以腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫離、移動(dòng)、種植并浸潤(rùn)生長(zhǎng)形成轉(zhuǎn)移灶或復(fù)發(fā)灶為特征。胰腺癌早期即可能發(fā)生淋巴、腹腔、肝

2、臟等部位的轉(zhuǎn)移。目前治療方法，無論是根治性手術(shù)或是化療，均不能顯著提高生存率。對(duì)胰腺癌轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)行為的機(jī)制研究，一直是熱點(diǎn)。以降低復(fù)發(fā)率及死亡率為目標(biāo)的對(duì)有效靶向治療的探索，是目前研究的出發(fā)點(diǎn)。四跨膜蛋白超家族(TM4SF)是特殊的細(xì)胞膜糖蛋白。Tspan1及Tspan8作為TM4SF家族中的成員，在胃癌、結(jié)腸癌、肝癌及食道癌中均為高表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移等臨床特征呈正相關(guān)性。但在胰腺癌中，目前沒有相關(guān)研究。Tspan1與T

3、span8復(fù)合體的形成會(huì)增加腫瘤細(xì)胞的遷徙性及浸潤(rùn)性。對(duì)Tspan1及Tspan8在胰腺癌中的惡性行為及機(jī)制的研究可能對(duì)于胰腺癌的預(yù)測(cè)、診斷、預(yù)后評(píng)估、靶向治療具有重大的臨床意義。
　　目的
　　本研究目的在于分析Tspan1及Tspan8在PDAC中表達(dá)與臨床特征的關(guān)系，評(píng)價(jià)其對(duì)PDAC預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值，并下調(diào)Tspan1基因表達(dá)，觀察其在胰腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)行為，探討其可能機(jī)制，為胰腺癌的診斷、治療及預(yù)后分析提供新的標(biāo)志物

4、及靶向治療目標(biāo)。
　　研究方法
　　一、實(shí)驗(yàn)材料
　　1、胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)組織石蠟切片95例及癌旁正常胰腺組織石蠟切片55例，來自外科手術(shù)切除蠟塊，并進(jìn)行組織切片對(duì)應(yīng)病例臨床資料采集。
　　2、胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3、HPAF-Ⅱ、Capan1、Capan2購(gòu)自中國(guó)中科院上海細(xì)胞庫(kù)。所有細(xì)胞采用貼壁細(xì)胞法培養(yǎng)、傳代及保留。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　　1、免疫組織化學(xué)(IHC)檢測(cè)PDAC及癌旁正

5、常組織中Tspan1及Tspan8表達(dá)，探討其表達(dá)的臨床病理學(xué)意義，進(jìn)行生存分析，繪制生存曲線，并分析其對(duì)PDAC預(yù)后的判斷價(jià)值。
　　2、qRT-PCR及Western印跡方法檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞株（BxPC-3、HPAF-Ⅱ、Capan1、Capan2）中Tspan1在mRNA及蛋白水平表達(dá)，篩選出表達(dá)量最高的胰腺癌細(xì)胞株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。
　　3、siTspan1轉(zhuǎn)染Bx-PC3，沉默Tspan1，通過qRT-PCR及West

6、er印跡法檢測(cè)沉默效率。
　　4、MTT法檢測(cè)Tspan1下調(diào)后胰腺癌細(xì)胞的增值變化;Transwell法檢測(cè)Tspan1下調(diào)后胰腺癌細(xì)胞遷徙及浸潤(rùn)能力變化;流式細(xì)胞檢測(cè)Tspan1下調(diào)后胰腺癌細(xì)胞凋亡情況。
　　研究結(jié)果
　　一、Tspan1、Tspan8在人胰腺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系
　　1、Tspan1和Tspan8表達(dá)集中于PDAC導(dǎo)管細(xì)胞膜，在癌旁組織中Tspan1、Tspan8無表達(dá)或

7、輕度表達(dá)，二者對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=7.429，P＜0.05;x2=15.1，P＜0.01)。
　　2、Tspan1高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期有正相關(guān)性（x2=6.688，P＜0.01;x2=13.055，P＜0.01）;Tspan8高表達(dá)與腫瘤TNM分期呈正相關(guān)性（x2=8.896，P＜0.05）。
　　3、Spearmanrank相關(guān)分析結(jié)果顯示Tspan1及Tspan8有統(tǒng)計(jì)學(xué)正相關(guān)性(r=0.223，P＜0

8、.05)。
　　4、Tspan1與PDAC的復(fù)發(fā)率呈正相關(guān)性(x2=6.116，P＜0.05)。
　　5、Tspan1及Tspan8高表達(dá)與生存期呈負(fù)相關(guān)(P＜0.01;P＜0.05);Tspan1及Tspan8表達(dá)水平可作為PDAC預(yù)后獨(dú)立預(yù)測(cè)因素(P＜0.01;P＜0.05)。
　　二、Tspan1在胰腺細(xì)胞中表達(dá)，下調(diào)Tspan1基因表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞株(Bx-PC3)增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響
　　1、q

9、RT-PCR結(jié)果顯示，Tspan1在BxPC-3、HPAF-Ⅱ、Capan1、Capan2細(xì)胞系中mRNA水平均有表達(dá)，Bx-PC3表達(dá)量最高。
　　2、Western印跡檢測(cè)顯示，Tspan1在BxPC-3、HPAF-Ⅱ、Capan1、Capan2細(xì)胞系中蛋白水平均有表達(dá)，BxPC-3表達(dá)量最高。
　　3、轉(zhuǎn)染效果檢測(cè)
　　(1)qRT-PCR.:
　　siTspan1轉(zhuǎn)染后，胰腺癌細(xì)胞Tspan1在mRNA水

10、平表達(dá)量明顯降低，干擾效果明顯，下調(diào)效率約為75％-90％。
　　(2)Western印跡檢測(cè):
　　Western印跡檢測(cè)顯示在27kd處有黑灰色條帶顯示，為Tspan1表達(dá)，NegativeControl組與Tspan1組條帶濃度基本一致，差異無顯著性（P＞0.05）;siTspan1組Tspan1表達(dá)條帶明顯淡于NegativeControl組及Tspan1組，差異有顯著性(P＜0.01)。
　　4、細(xì)胞增殖檢測(cè)

11、(MTT)
　　MTT檢測(cè)siTspan1干擾后胰腺癌細(xì)胞株的增殖功能，通過采集0、24、48、72、96、120時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)，Negativecontrol組、Tspan1組與siTspan1組比較結(jié)果顯示，siTspan1干擾對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖能力統(tǒng)計(jì)學(xué)差異無顯著性(P＞0.05;P＞0.05)。
　　5、siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移能力檢測(cè)
　　Transwell顯示，應(yīng)用顯微鏡記錄Tspan1、siTspan1及Ne

12、gativecontrol細(xì)胞的遷移能力的差異，并對(duì)8個(gè)不同視野(×100)進(jìn)行計(jì)數(shù)，并重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，通過計(jì)算得到siTspan1轉(zhuǎn)染細(xì)胞較Negativecontrol轉(zhuǎn)染細(xì)胞及Tspan1細(xì)胞遷徙減少百分比，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siTspan1后與Negativecontrol及Tspan1細(xì)胞對(duì)比，明顯降低細(xì)胞的遷徙能力(P＜0.01;P＜0.01)。
　　6、siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)
　　BioCoatMatrigeli

13、nvasionchamber進(jìn)行檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞侵襲能力的變化，應(yīng)用顯微鏡記錄Tspan1、siTspan1及Negativecontrol細(xì)胞的侵襲能力的差異，對(duì)8個(gè)不同視野(×100)進(jìn)行計(jì)數(shù)，并重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，通過計(jì)算得到siTspan1轉(zhuǎn)染細(xì)胞較Negativecontrol轉(zhuǎn)染細(xì)胞及Tspan1細(xì)胞遷徙減少百分比，如圖，可見瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siTspan1后，穿膜細(xì)胞數(shù)較少，與Negativecontrol組及Tspan1組對(duì)

14、比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05;P＜0.05)，下調(diào)Tspan1會(huì)明顯降低Bx-PC3細(xì)胞的侵襲能力。
　　7、檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響
　　AnnexinⅤmethod結(jié)果顯示，Tspan1、siTspan1、NegativeControl各組凋亡率分別為0.75％、9.56％、0.12％，siTspan1與Negativecontrol及Tspan1組對(duì)比，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性(P＜0.05;P＜0.05)。下調(diào)