ALDOA在胰腺癌中表達的意義和功能的初步研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、胰腺癌是一種高度惡性的消化系統(tǒng)腫瘤,預(yù)后極差。在西方國家,胰腺癌排名惡性腫瘤死因的第4位。2011年,美國胰腺癌新發(fā)病例數(shù)為44030例,死亡37660例,5年生存率僅有6%。隨著近年來經(jīng)濟的發(fā)展,污染的加重,生活習慣的西方化,中國胰腺癌的發(fā)病率也逐年上升。據(jù)上海市流行病學統(tǒng)計數(shù)據(jù),2009年上海市胰腺癌發(fā)病率已上升至男性17.28/10萬,女性14.04/10萬。強烈的局部侵襲能力和早期轉(zhuǎn)移能力是導(dǎo)致胰腺癌病人極差預(yù)后的主要原因,大部

2、分胰腺癌患者在得到診斷的時候因發(fā)現(xiàn)有局部侵犯或遠處轉(zhuǎn)移而不能獲得根治性手術(shù)切除。胰腺癌的發(fā)生發(fā)展是多因素在多階段作用的過程,包括癌基因的活化、抑癌基因的失活以及突變。隨著分子生物學的進展,研究領(lǐng)域的不斷開拓,越來越多的新基因和基因的新功能被大家所發(fā)現(xiàn)。基于干預(yù)相關(guān)基因功能的分子靶向治療給胰腺癌患者帶來了曙光。如果將分子靶向治療和傳統(tǒng)治療方式聯(lián)合很有可能會改善胰腺癌的預(yù)后,提高胰腺癌患者的生存時間和生活質(zhì)量。醛縮酶A(aldolase A

3、,ALDOA),指參與催化裂解1.6-二磷酸-D-果糖,生成3-磷酸-D-甘油醛和α-二羥丙酮磷酸的酶。是一種幾乎存在于一切生物體中并參與其糖酵解的重要酶。醛縮酶A參與了許多細胞功能,如肌肉的維持,橫紋肌的收縮,細胞形態(tài)和運動的調(diào)節(jié),ATP的合成及肌動蛋白絲的組織。ALDOA已被證實在人體絕大部分組織器官均有不同程度的表達,并且在多種惡性腫瘤中異常高表達,其表達高低被認為和多種惡性腫瘤的分化、TNM分期及預(yù)后相關(guān)。目前的研究表明ALDO

4、A可能通過調(diào)控多條信號通路而影響腫瘤的發(fā)生、增殖、抗凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成、耐藥等多個環(huán)節(jié)。ALDOA很可能作為一個廣譜性的標志物,在惡性腫瘤的診斷、治療及預(yù)測預(yù)后中發(fā)揮巨大作用。目前國內(nèi)外尚未有ALDOA與胰腺癌發(fā)病的相關(guān)報道。在本課題中,我們首先通過高通量組織芯片免疫組織化學技術(shù)分析了ALDOA在胰腺癌和配對癌旁組織的表達模式,以及ALDOA在癌組織中表達高低與患者臨床病理特征的關(guān)系和潛在預(yù)測預(yù)后的價值,證實ALDOA評分和分化

5、及TNM分期相關(guān),并且是胰腺癌獨立的預(yù)后因素。其次,我們檢測了ALDOA在不同胰腺癌細胞系中的表達差異,選取高表達ALDOA的胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1和MIAPaCa-2為研究對象,采用RNA干擾技術(shù),構(gòu)建ALDOA的RNAi慢病毒載體,并獲得了穩(wěn)定干擾ALDOA表達的胰腺癌細胞株。最后,我們通過體外實驗研究抑制ALDOA表達后,胰腺癌細胞的增殖凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化,證實了干擾胰腺癌中ALDOA的表達,可以抑制胰腺癌細胞的增殖和侵襲

6、轉(zhuǎn)移。ALDOA作為胰腺癌的獨立預(yù)后因素以及潛在治療靶點,值得我們進一步研究。本研究分為兩個部分:
  第一部分:ALDOA在胰腺癌臨床組織中的表達及臨床意義。
  目的:研究胰腺癌中ALDOA在癌組織和癌旁組織中的表達差異,分析ALDOA與胰腺癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。
  方法:通過組織芯片免疫組化染色檢測96對胰腺癌及配對癌旁組織中的ALDOA蛋白水平的表達情況。使用秩和檢驗分析ALDOA染色評分和CA19

7、-9高低、TNM分期、腫瘤分化、生存時間等臨床病理資料的相關(guān)性,累計生存時間和累計生存率采用Kaplan-Meier法,生存檢驗采用Log-rank法,采取Cox比例風險模型進行單因素和多因素分析。
  結(jié)果:組織芯片免疫組化結(jié)果提示:ALDOA在胰腺癌組織的表達水平要高于配對癌旁組織(高表達率:癌64/96,66.7%;癌旁32/96,33.3%),ALDOA在胰腺癌組織中主要在細胞漿表達較明顯,而在癌旁正常導(dǎo)管中,ALDOA染

8、色較淺,且一般為均勻分布于細胞漿中。胰腺癌組織ALDOA蛋白高表達(染色指數(shù)>6)與生存時間短(p<0.001),腫瘤細胞分化差(P=0.026)相關(guān)。Kaplan-Meier法分析ALDOA評分高低(p<0.001)、腫瘤分化高低(p<0.001)、TNM分期早晚(P=0.004)的患者生存時間存在統(tǒng)計學差異。進一步行Cox回歸多因素分析提示ALDOA是胰腺癌患者術(shù)后死亡風險的獨立危險因素(HR=2.379,95% CI=1.357-

9、4.170,P=0.002)。
  結(jié)論:在人胰腺癌組織中ALDOA蛋白表達普遍高于癌旁組織,主要表達在胞漿。ALDOA的高表達與的臨床病理因素(分化差、TNM分期晚)顯著相關(guān)。ALDOA染色評分與患者的預(yù)后密切相關(guān),是胰腺癌患者術(shù)后死亡風險的獨立危險因素。
  第二部分:干擾ALDOA表達對胰腺癌惡性潛能的影響。
  目的:構(gòu)建ALDOA基因特異性shRNA真核表達載體,建立穩(wěn)定干擾ALDOA表達的胰腺癌細胞,研究干

10、擾ALDOA對于胰腺癌細胞系PANC-1和MIAPaCa-2體外增殖、周期、凋亡、遷移和侵襲能力的影響;初步探索胰腺癌中干擾ALDOA后增殖、轉(zhuǎn)移、周期相關(guān)指標的變化。
  方法:Western blot檢測人胰腺癌細胞系中ALDOA的表達,選擇高表達ALDOA的細胞系為后續(xù)研究對象。設(shè)計合成ALDOA基因特異性的shRNA序列,以慢病毒載體pLKO.1TRC cloning vector為基礎(chǔ)構(gòu)建ALDOA基因特異性shRNA重

11、組真核表達載體。包裝生成相應(yīng)慢病毒并轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞系,嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達重組載體的胰腺癌細胞系。通過CCK-8法檢測細胞增殖能力,PI染色法分析細胞周期,平板克隆形成實驗比較細胞增殖和群體依賴性變化,細胞劃痕實驗評估細胞遷移能力。利用Western blot檢測E-cadherin,Snail和CyclinD1的表達變化,探索胰腺癌中干擾ALDOA對增值及侵襲轉(zhuǎn)移的影響。免疫組化驗證ALDOA與E-cadherin相關(guān)性。
  

12、結(jié)果:Western blot結(jié)果顯示在6株胰腺癌細胞系中PANC-1和MIAPaCa-2中ALDOA蛋白含量最高。設(shè)計合成的ALDOA基因特異性shRNA單鏈成功退火形成雙鏈shRNA。用重組質(zhì)粒包裝慢病毒并成功轉(zhuǎn)染PANC-1和MIAPaCa-2細胞,采用嘌呤霉素成功篩選獲得穩(wěn)定表達重組質(zhì)粒的胰腺癌細胞株。CCK-8細胞增殖實驗提示,下調(diào)ALDOA表達水平后,不同時間點的PANC-1和MIAPaCa-2細胞系的增殖能力明顯減弱。細胞

13、周期分析提示:干擾ALDOA后,人胰腺癌細胞PANC-1和MIAPaCa-2均出現(xiàn)G1增多,G2和S期減少,發(fā)生G1期阻滯。平板克隆實驗證實ALDOA表達的下調(diào)明顯抑制了PANC-1和MIAPaCa-2的增殖以及增加了其群體依賴性。細胞劃痕實驗證實ALDOA表達減少后PANC-1和MIAPaCa-2遷移能力明顯減弱。Western blot檢測干擾ALDOA后Snail和CyclinD1下調(diào),E-cadherin上調(diào),提示胰腺癌中ALD

14、OA可以通過調(diào)控周期、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因從而影響胰腺癌的生物學行為。通過免疫組化染色進一步驗證ALDOA高表達的組織E-cadherin呈現(xiàn)相對低表達,而ALDOA低表達的組織E-cadherin呈現(xiàn)高表達?;匮a實驗也進一步證明ALDOA與胰腺癌EMT密切相關(guān),并且ALDOA是通過其催化活性的改變影響EMT表型從而影響胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的。
  結(jié)論:以ALDOA為靶點的RNAi可以有效抑制人胰腺癌細胞PANC-1和MiaPaCa-2的

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