幽門螺桿菌HspA及CTB-HspA融合蛋白在家蠶中的表達與免疫效果研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是主要定植于宿主胃和十二指腸粘液或粘膜處的一種重要致病菌，與多種胃病及十二指腸疾病有密切關(guān)系。Hp是一種全球范圍的人類致病菌，世界上約有50％以上的人口感染此病原菌，我國目前約有50％～80％的感染人群，它是目前所知的人類感染率最高的感染菌之一，對人類身體健康造成了嚴重的危害?，F(xiàn)如今，針對此病原菌最常用的是聯(lián)合質(zhì)子泵抑制劑和兩種或三種抗生素的療法，雖然該療法有較好的療效，但耐藥性

2、增強、不良反應(yīng)和高費用等因素使抗生素療法面臨嚴重的挑戰(zhàn)；另外，該療法只針對有病癥的患者，因此，如何在廣大的人群中有效控制Hp的感染，避免其誘發(fā)的一系列疾病的發(fā)生和發(fā)展，具有非常重要的意義?；蛞呙缇哂杏行У念A(yù)防性和治療性，有望成為控制Hp感染的最有效和最有前景的方法之一。
　　 本研究選擇Hp具有較強的免疫原性的熱休克蛋白A亞單位(HspA)進行研究，首先將HspA基因克隆至原核表達載體pET-32a(+)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.c

3、oliBL21(DE3)，成功構(gòu)建了重組表達菌株(pET-32a-HspA)；另外，為增強Hp抗原的免疫原性，Hp疫苗需配合免疫粘膜佐劑共同進行免疫試驗，因此同時構(gòu)建了免疫佐劑霍亂毒素B亞單位(CTB)的E.coli重組表達菌(pET-32a-CTB)，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒進行測序和序列同源性比較后發(fā)現(xiàn)，所得基因序列與Genbank公布的序列有非常高的同源性。分別將兩組重組菌進行誘導(dǎo)表達和鑒定，結(jié)果表明，重組菌可成功誘導(dǎo)表達目的蛋白，且W

4、estern blotting鑒定結(jié)果證實其具有良好的免疫原性；對表達蛋白利用Ni2+-NTA柱親和層析及凝膠過濾層析和陰離子交換層析等一系列純化可得到純度為90％以上的目的蛋白，將純化后的HspA抗原蛋白進行初步結(jié)晶條件的摸索，為Hp的防治奠定一定的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；對純化的CTB蛋白進行GM1-ELSA活性測定，結(jié)果證明其有良好的GM1結(jié)合活性，為后續(xù)佐劑研究奠定基礎(chǔ)。
　　 同時，本研究利用重疊延伸PCR法成功利用(Gly4Ser

5、)3連接肽序列構(gòu)建了CTB-HspA融合基因，生物信息學(xué)分析結(jié)果可知Linker兩端的蛋白保持原有的二級結(jié)構(gòu)、抗原性和親水性。利用Bac-to-Bac系統(tǒng)成功構(gòu)建了重組桿狀病毒vBmCTB-HspA，分別感染家蠶BmN細胞、五齡幼蟲和蠶蛹，利用家蠶生物反應(yīng)器中表達的HspA抗原和CTB-HspA融合蛋白，并對分別其進行SDS-PAGE電泳和Western blotting分析鑒定，結(jié)果表明目的蛋白在家蠶BmN細胞、五齡幼蟲和蠶蛹均成功表