人卵巢組織玻璃化冷凍及其對印記基因IGF-2-H19的影響.pdf

1、本研究首次探討人卵巢組織冷凍對生殖細(xì)胞印記基因IGF-2／H19是否有影響，比較慢速程序化和固相表面玻璃化冷凍對卵巢組織中原始和初級卵泡IGF-2／H19基因CpG島的甲基化狀態(tài)及兩基因在卵泡中表達(dá)的影響。 本研究分三部分： 1.探討固相表面玻璃化技術(shù)和其它載體相比，對人卵巢組織玻璃化冷凍的效果，并在優(yōu)選載體的基礎(chǔ)上，比較不同濃度冷凍保護(hù)劑對卵巢組織中卵泡形態(tài)的影響及玻璃化冷凍效果； 2.比較固相表面玻璃化冷凍和

2、傳統(tǒng)程序化冷凍對人卵巢組織凍存的效果； 3.比較固相表面玻璃化冷凍和程序化冷凍對印記基因IGF-2／H19差異甲基化區(qū)(DMR)關(guān)鍵CpG島甲基化程度及兩基因在原始卵泡和初級卵泡表達(dá)的影響。 第一章　玻璃化冷凍方案對人卵巢組織凍存的研究　　目的：探討固相表面玻璃化冷凍和其它載體相比，對人卵巢組織玻璃化冷凍的效果，并優(yōu)選的玻璃化載體基礎(chǔ)上，比較不同濃度冷凍保護(hù)劑對卵巢組織的毒性和冷凍效果，優(yōu)選出適合人卵巢皮質(zhì)的玻璃化冷凍

3、方案。 方法 1、標(biāo)本預(yù)處理和分組手術(shù)中取得16例卵巢組織，及時切割成5mmx1mmx1mm的皮質(zhì)小條，隨機(jī)分到不同處理組：新鮮組(F組)和不同玻璃化組，包括冷凍管玻璃化組(TV組)、最小微滴玻璃化組(MDS組)、不銹鋼網(wǎng)篩玻璃化組(SLV組)和固相表面玻璃化組(SSV組)。 2、玻璃化冷凍和復(fù)溫采用20％DMSO+20％EG溶液作玻璃化冷凍液，梯度滲透卵巢皮質(zhì)，采用不同載體系統(tǒng)行玻璃化快速冷凍并于液氮保存。復(fù)

4、溫時，將組織置于37℃ 1 M蔗糖溶液中快速解凍后，經(jīng)梯度蔗糖濃度逐步洗脫冷凍保護(hù)劑。 3、體外培養(yǎng)和檢測指標(biāo)①各組凍融后的卵巢皮質(zhì)一部分用于體外培養(yǎng)，每隔一天檢測培養(yǎng)液中雌二醇和孕酮的濃度； ②新鮮組、其余凍融后皮質(zhì)以及培養(yǎng)后組織經(jīng)4％多聚甲醛固定后，制備HE切片，用于組織學(xué)觀察卵泡形態(tài)，盲法計數(shù)形態(tài)正常及異常的卵泡。 4、不同濃度冷凍液對卵巢組織毒性和用于固相表面玻璃化效果的比較 結(jié)論: 1、

5、玻璃化冷凍可以保存卵巢組織中大部分原始卵泡和初級卵泡的正常形態(tài)，并能較好的保存其體外生長和性激素分泌功能； 2、將固相表面玻璃化冷凍技術(shù)用于人卵巢組織冷凍，與冷凍管、最小微滴法、不銹鋼網(wǎng)篩相比，首次證明使用的半懸于液氮中的鋁箔做載體的SSV技術(shù)更適合人卵巢組織的玻璃化冷凍； 3、與15％DMSO+15％EG相比，采用20％DMSO+20％EG為冷凍液并結(jié)合SSV技術(shù)是一適合人卵巢組織冷凍的有效玻璃化方案。 第二章

6、人卵巢組織固相表面玻璃化冷凍和程序化冷凍的比較研究　　目的：比較固相表面玻璃化冷凍和傳統(tǒng)程序化冷凍對人卵巢組織凍存的效果。 方法: 1、標(biāo)本預(yù)處理和分組臨床取得26例卵巢組織，切割成5mm×1mm×1mm皮質(zhì)小條，隨機(jī)分到不同處理組：新鮮組(F組)、固相表面玻璃化組(SSV組)和程序化冷凍組(SF組)。 2、卵巢組織冷凍和復(fù)蘇 ①固相表面玻璃化冷凍：采用第一章優(yōu)化的SSV冷凍方案； ②程序化冷凍

7、：采用被廣泛認(rèn)可的Gosden程序化冷凍方案。 3、體外培養(yǎng)和檢測指標(biāo) 結(jié)論: 固相表面玻璃化冷凍和程序化冷凍都能較好的保存人卵巢組織中絕大部分原始和初級卵泡的正常形態(tài)以及解凍后體外培養(yǎng)時的生長能力和性激素分泌功能，兩者對人卵巢組織的凍存效果相當(dāng)。 第三章　人卵巢組織固相表面玻璃化和程序化冷凍對印記基因IGF-2/H19甲基化程度及其在卵泡表達(dá)的影響　　目的：探討固相表面玻璃化冷凍和程序化冷凍對印記基因

8、IGF-2／H19差異甲基化區(qū)(DMR)關(guān)鍵CpG島甲基化程度及兩基因在原始卵泡和初級卵泡表達(dá)的影響。 方法: 1、卵巢組織的預(yù)處理和分組同第二章 2、固相表面玻璃化冷凍和程序化冷凍的過程同第二章 3、檢測指標(biāo) 結(jié)論: 1、未檢測到固相表面玻璃化冷凍和程序化冷凍對印記基因IGF-2／H19 DMR關(guān)鍵CpG位點甲基化程度有影響； 2、未發(fā)現(xiàn)兩種冷凍方法對原始和初級卵泡中IGF-2蛋