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文檔簡介
1、第一部分胚鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的體外培養(yǎng)、鑒定及神經(jīng)元缺氧模型的建立與評價 目的:建立胚鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)體系和建立神經(jīng)元缺氧培養(yǎng)模型,并對神經(jīng)元缺氧模型進(jìn)行形態(tài)學(xué)評價。 方法: 1.改良目前被廣泛使用的方法,采取聯(lián)合使用0.05%胰酶及10IU/mlDNase I獲取神經(jīng)元單細(xì)胞懸液,以加入2%B27,5%胎牛血清,1%Glutamax的Neurobasal Medium作為接種及維持培養(yǎng)基,接種48小時加入阿糖胞
2、苷抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長,綜合使用上述方法建立體外神經(jīng)元培養(yǎng)體系; 2.使用Tubulin βⅢ單克隆抗體標(biāo)記神經(jīng)元,GFAP多克隆抗體標(biāo)記星型膠質(zhì)細(xì)胞,運用免疫熒光技術(shù)檢測胚鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元純度:3.使 用國產(chǎn)厭氧培養(yǎng)箱充入85%N2、5%CO2、10%H2混合氣建立胚鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元的缺氧模型;4.倒置相差顯微鏡下觀察缺氧不同時點胚鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元,對神經(jīng)元缺氧模型進(jìn)行形態(tài)學(xué)評價。 結(jié)果: 1.聯(lián)合使用0.05%胰
3、酶及10IU/m1DNase Ⅰ消化胚鼠大腦皮質(zhì),使用加入2%B27,5%胎牛血清,1%Glutamax的Neurobasal Medium作 為接種及維持培養(yǎng)基,接種48小時后加入阿糖胞苷抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長,可獲取純度在95%以上的胚鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元; 2.培養(yǎng)的胚鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的純度>95%,星型膠質(zhì)細(xì)胞的沾染率 <5%;3.倒置相差顯微鏡觀察顯示在缺氧4小時后,神經(jīng)元胞漿內(nèi)開始出現(xiàn)空泡,折光性減弱;缺氧8小時后,細(xì)胞胞體皺
4、縮,胞漿中空泡明顯,部分細(xì)胞可見崩解現(xiàn)象;缺氧12小時,大部分細(xì)胞輪廓模糊,胞體固縮成團,出現(xiàn)明顯的核碎裂與核溶解;缺氧16小時,細(xì)胞崩解現(xiàn)象加?。蝗毖?4小時,細(xì)胞及其突起幾乎完全崩解消失。 結(jié)論: 1. 成功建立了高純度神經(jīng)元體外培養(yǎng)體系; 2. 使用國產(chǎn)厭氧培養(yǎng)箱充入85%N<,2>、5%CO<,2>、10%H<,2>混合氣可成功建立胚鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元的缺氧模型; 3.體外培養(yǎng)0—8小時是神經(jīng)元對
5、缺氧最為敏感的時間。 第二部分 鈣信號通路在缺氧性損傷中的作用 目的:探討鈣信號系統(tǒng)在缺氧性腦損傷中的作用及與BDNF抗缺氧性損傷間的關(guān)系。 方法:分別采用L-VSCC阻滯劑尼莫地平、NMDA受體阻滯劑MK-801、AMPA受體阻滯劑CNQX拮抗胞外鈣內(nèi)流,并采用CaMKⅡ阻滯劑KN-93拮抗CoMKⅡ,使用MTT法及LDH法檢測細(xì)胞活性,對比單純?nèi)毖踅M,各種鈣拮抗劑干預(yù)組,BDNF干預(yù)組及BDNF+拮抗劑干預(yù)
6、組細(xì)胞活性的差別。 結(jié)果: 1.使用尼莫地平干預(yù)組,MK-801干預(yù)組及KN-93干預(yù)組細(xì)胞活性較單純?nèi)毖踅M高,CNQX的作用不肯定,聯(lián)合使用MK-801及CNQX組細(xì)胞活性反而較單純?nèi)毖踅M低。 2.各種阻滯劑干預(yù)組與阻滯劑+BDNF組比較,細(xì)胞活性無顯著性差別,各種阻滯劑+BDNF干預(yù)組與BDNF干預(yù)組細(xì)胞活性無顯著性差異。 結(jié)論: 1.鈣信號系統(tǒng)參與了神經(jīng)元的缺氧性損傷; 2.L-VS
7、CC通道及NMDA受體可能是啟動缺氧性神經(jīng)元損傷的主要鈣信號通道,AMPA通道不起主要作用,CaMKⅡ參與了神經(jīng)元的缺氧性損傷。 3.通過L-VSCC,NMDA受體,AMPA受體介導(dǎo)的鈣內(nèi)流可能不是BDNF減輕神經(jīng)元缺氧損傷的主要信號通路。 第三部分 神經(jīng)元缺氧性損傷中細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的波動 目的:探討神經(jīng)元缺氧損傷中細(xì)胞內(nèi)游離鈣的波動。 方法:以Fluo-4AM作為鈣熒光探針,采用激光共聚焦顯微鏡掃描的
8、方式測定細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度。 結(jié)果: 1.鈣離子濃度并非隨缺氧時間延長成線形增長,在缺氧4小時達(dá)頂峰,缺氧時間延長后>6hr,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度反而降低; 2.BDNF干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度較單純?nèi)毖踅M高; 3.尼莫地平干預(yù)組及MK-801干預(yù)組出現(xiàn)了明顯的鈣振蕩; 4.尼莫地平可短期迅速降低缺氧神經(jīng)元的細(xì)胞內(nèi)鈣,但隨缺氧時間的延長,細(xì)胞內(nèi)鈣仍可達(dá)到很高的水平;MK-801干預(yù)組可長時間降低缺氧
9、神經(jīng)元的細(xì)胞內(nèi)鈣,但其短期阻滯鈣內(nèi)流的效率不如尼莫地平。 5.KN-93基本不能降低缺氧神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣水平。 結(jié)論: 1.缺氧刺激可激活鈣信號系統(tǒng),引起胞外鈣內(nèi)流; 2.激活鈣信號通路可能是BDNF抗缺氧性腦損傷的機理之一; 3.阻滯胞外鈣過度內(nèi)流,避免細(xì)胞內(nèi)鈣超載可能是尼莫地平,MK-801,CNQX對缺氧神經(jīng)元保護作用的一個重要原因; 4.KN-93對神經(jīng)元的保護作用不是減少鈣超載。
10、 第四部分 鈣信號通路在缺氧神經(jīng)元損傷中的機理研究 目的:探討參與缺氧性腦損傷主要的鈣信號通路 方法:采用免疫印跡技術(shù)檢測單純?nèi)毖踅M,BDNF干預(yù)組,各種鈣通路阻滯劑干預(yù)組及BDNF+鈣通道阻滯劑干預(yù)組在pCREB、CaMKⅡ、CaMKIV、pERK及pAKT的表達(dá)方面的差異。 結(jié)果: 1.缺氧刺激可誘導(dǎo)CaMKⅡ表達(dá)的下調(diào)及CaMKⅣ表達(dá)的上調(diào); 2.KN-93可顯著抑制CaMKⅡ的表
11、達(dá),尼莫地平也可使CaMKⅡ的表達(dá)明顯減少,CNQX可使CaMKⅡ的表達(dá)部分減少,但胍MK-801似乎對CaMKⅡ的表達(dá)無明顯影響; 3.MK-801可明顯抑制CaMKIV的表達(dá),其次為尼莫地平,而KN-93對CaMKⅣ表達(dá)的抑制作用不明顯: 4.缺氧可使磷酸化CREB的表達(dá)增加,而BDNF干預(yù)可使磷酸化CREB的表達(dá)持續(xù)增加; 5.MK-801,CNQX,KN-93及尼莫地平均可使pCREB不表達(dá)或表達(dá)明顯減少
12、; 6.尼莫地平可使磷酸化ERKl/2的表達(dá)顯著減少; 7.尼莫地平,CNQX及KN-93均明顯抑制磷酸化AKT表達(dá): 8.使用鈣通路阻滯劑后對BDNF干預(yù)組磷酸化ERKl/2的表達(dá)無明顯影響: 9.使用各種鈣通路阻滯劑,可明顯減弱由BDNF激活的AKT表達(dá)。 結(jié)論: 1.缺氧刺激可誘導(dǎo)CaHKⅡ表達(dá)的下調(diào)及CaMKIV表達(dá)的上調(diào); 2.經(jīng)過L-VSCC的鈣內(nèi)流可能是激活CaMKⅡ
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