CaCCs通道鈣離子依賴性分子機(jī)制的研究.pdf

1、　　鈣激活氯離子通道(CaCCs)是一種廣泛存在的氯離子通道,參與眾多生理功能,如：上皮細(xì)胞的氯離子分泌、嗅覺(jué)傳導(dǎo)以及平滑肌收縮等。由于通常情況下很難將CaCCs介導(dǎo)的電流和鈣離子依賴性陽(yáng)離子流以及非鈣離子依賴性氯離子流分開,所以對(duì)其電生理特性的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于其他離子通道。近來(lái),TMEM16A被確認(rèn)為CaCCs通道的分子基礎(chǔ),這為進(jìn)一步研究其電生理特點(diǎn)提供了可能。
　　鈣離子和電壓雙重依賴性激活機(jī)制是 TMEM16A 通道典型

2、的電生理特性。然而,在TMEM16A通道內(nèi)部卻不存在已知的鈣離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域,如CaM的EF-hand,BK通道內(nèi)的“Ca2+-bowl‖等。而確定TMEM16A通道的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)是研究其鈣依賴性激活機(jī)制的前提。
　　本文結(jié)合課題組龐春麗博士理論模擬結(jié)果和高崇森同學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,分為兩個(gè)部分來(lái)研究TMEM16A的激活機(jī)制：
　　一、 TMEM16A通道Ca2+結(jié)合位點(diǎn)的研究
　　本文首次采用同源模建和分子動(dòng)力

3、學(xué)模擬等理論方法結(jié)合定點(diǎn)突變和膜片鉗技術(shù),以TMEM16A通道為研究對(duì)象,力圖明確通道內(nèi)鈣離子結(jié)合位點(diǎn),得到以下結(jié)論：
　　1. TMEM16A通道胞內(nèi)側(cè)第一個(gè)Loop內(nèi)的D439、E444和E447三個(gè)氨基酸同鈣離子直接相互作用,并與三個(gè)水分子共同形成鈣離子結(jié)合位點(diǎn)。
　　2. 在以上形成鈣離子結(jié)合位點(diǎn)的三個(gè)氨基酸中,D439 和 E444 各貢獻(xiàn)一個(gè)氧原子,而E447貢獻(xiàn)兩個(gè)氧原子和鈣離子相互作用,即E447對(duì)于

4、通道對(duì)鈣離子親和力影響最大。
　　3. TMEM16A通道胞內(nèi)側(cè)第一個(gè)Loop內(nèi)的D452和E457盡管也可以和水分子共同形成鈣離子結(jié)合位點(diǎn),但是它們并不會(huì)影響通道門控動(dòng)力學(xué)行為。
　　二、 二價(jià)陽(yáng)離子激活TMEM16A通道機(jī)制的初步探討
　　本課題組和其他實(shí)驗(yàn)室前期研究表明,Ca2+以外的其他二價(jià)陽(yáng)離子對(duì)TMEM16A通道也具有一定的激活作用。對(duì)于不同二價(jià)陽(yáng)離子激活TMEM16A的研究是研究該通道鈣離子依

5、賴性激活機(jī)制的有益補(bǔ)充。然而,就二價(jià)離子和鈣離子在激活TMEM16A通道過(guò)程中相互關(guān)系的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。
　　本論文以表達(dá)于HEK293細(xì)胞系的TMEM16A為研究對(duì)象,采用膜片鉗內(nèi)向外記錄模式,通過(guò)研究不同二價(jià)陽(yáng)離子共同存在時(shí)對(duì)CaCCs的影響,從而判斷二價(jià)陽(yáng)離子之間是否存在協(xié)同作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：
　　1. 兩種二價(jià)陽(yáng)離子共同存在時(shí)( Ca2+ +Sr2+,Ca2++Ni2+),并不能更大程度的激活TMEM1