毒毛旋花子苷原引起海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣變化機制研究.pdf

1、目的：Na+，K+-ATP酶（NKA）是一類廣泛存在于真核生物細胞膜中的跨膜蛋白，在跨膜轉(zhuǎn)運中維持Na+、K+的離子梯度，這種梯度對調(diào)節(jié)滲透壓的平衡、靜息電位的水平和生電性細胞（組織）如神經(jīng)和肌肉的興奮性具有重要的作用。強心類甾醇(CTS)是一類與Na+，K+-ATP酶特異性結(jié)合的化學物質(zhì)，可在許多生理和病理條件下調(diào)節(jié)Na+，K+-ATP酶。在腦缺血、缺氧、中毒等病理條件下，Na+，K+-ATP酶的活性降低，Na+，K+-ATP酶被抑制

2、，導致細胞內(nèi)[Ca2+]i升高，從而引起細胞的損傷，故NKA是參與神經(jīng)元損傷的機制之一，本研究主要選取對缺血、缺氧敏感的海馬神經(jīng)元，研究Na+，K+-ATP酶抑制劑毒毛旋花子苷原(Strophanthin，Str)對神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣的影響，并分析其作用機制。
　　 方法：①海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)：取出生24小時內(nèi)的乳鼠，斷頭，取腦，放入冰浴的D-Hanks液中，分離海馬，剪成約1mm3小塊，加入4～5倍組織塊體積的0.125％的胰蛋

3、白酶，37℃，消化10分鐘，種植液沖洗3次后，用火焰刨光的玻璃吸管吹打制成細胞懸液，用種植培養(yǎng)液將細胞濃度調(diào)至1～2×106/ml。將細胞懸液種于預先鋪好多聚賴氨酸的24孔細胞培養(yǎng)板中，3～5小時后給細胞補液。24小時后，全量換成飼養(yǎng)液，以后每3天換1次液，培養(yǎng)至7-14天用于實驗。②激光共聚焦掃描顯微鏡測定海馬神經(jīng)元[Ca2+]i的變化：Fluo-420μmol/L37℃孵育神經(jīng)元40min后，激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長530nm，

4、對細胞XYT平面進行掃描，間隔時間為10秒，連續(xù)掃描30分鐘，[Ca2+]i變化通過給藥前后熒光強度比值R表示(R=Ft/F0)。
　　 結(jié)果：1神經(jīng)元的形態(tài)學觀察接種后1～2小時海馬神經(jīng)元開始貼壁，細胞呈圓形或橢圓形，3天后，多數(shù)細胞從胞體長出數(shù)個突起，在7～10天開始成熟，胞體逐漸長至30～40μm，暈光明顯，胞核和核仁清晰可見，突起變粗、變長并且有分支，14天后神經(jīng)細胞生長最為豐滿，胞體呈圓形或多角形，四周暈光明顯。Flu

5、o-4負載后，可在共聚焦顯微鏡下觀察到海馬神經(jīng)元細胞胞漿內(nèi)的綠色熒光。
　　 2Str對海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣的影響
　　 用含有不同濃度的Str（10-10、10-8、10-6、10-5和10-3mol/L）的HBSS灌流海馬神經(jīng)元，實驗結(jié)果表明，給藥前海馬神經(jīng)元的平均熒光強度為60-110，給予不同濃度的Str后，海馬神經(jīng)元平均熒光強度明顯增加，其熒光強度分別是給藥前熒光強度的109.4％、127.0％、172.7％、1

6、98％和274.1％，且呈劑量依賴性，從而提示Str可部分或全部抑制Na+，K+-ATP酶的活性，Str濃度越大，其抑制作用越強，升高海馬神經(jīng)元[Ca2+]i的作用越大。
　　 3谷氨酸釋放對Str誘導的海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣升高的影響
　　 實驗選用Str的濃度為10-8mol/L和10-5mol/L，10-8mol/LStr可抑制高親合力Na+，K+-ATP酶a2和α3亞基的活性，10-5mol/LStr可抑制低親合力N

7、a+，K+-ATP酶ai亞基的活性。用含有NMDA受體阻斷劑D-APV(50μM)和AMPA/Kainate受體阻斷劑CNQX（10μM）的HBSS灌流海馬神經(jīng)元，二者對神經(jīng)元[Ca2+]i均無明顯影響(n=52，p＞0.05)。灌流給予Str+D-APV(50μM)和Str+CNQX(10μM)后，低濃度的Str(10-8mol/L)引起Ca2+的熒光強度變化的比值是1.317±0.01和1.314±0.017，與對照組相比無明顯統(tǒng)計

8、學意義(p＞0.05)；高濃度的Str(10-5mol/L)引起Ca2+的熒光強度變化的比值是1.925士0.071和1.910士0.031，與對照組相比也無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，從而提示海馬神經(jīng)元谷氨酸的釋放對Str誘導[Ca2+]i的升高無明顯影響。
　　 4細胞外鈣對Str誘導的海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣升高的影響
　　 海馬神經(jīng)元用正常的HBSS灌流5分鐘后，將灌流液換成含鈣離子螯合劑EGTA1mM的無鈣生理鹽溶液

9、，海馬神經(jīng)元[Ca2+]i無明顯變化(p＞0.05)，5分鐘后在灌流液中分別加入高濃度的Str（10-5mol/L）和低濃度的Str(10-8mol/L)，低濃度的Str(10-8 mol/L)引起Ca2+的熒光強度變化的比值是1.063士0.005(p＜0.01)，高濃度的Str(10-5mol/L)引起Ca2+的熒光強度變化的比值是1.099士0.018(p＜0.01)，與對照相比二者均可使海馬神經(jīng)元[Ca2+]i明顯降低，從而提示

10、細胞外鈣內(nèi)流是Str誘導[Ca2+]i的升高參與機制之一。為進一步證實細胞外鈣對Str誘導的海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣升高的影響，用含有電壓依賴性鈣通道阻滯劑Nimodipine（50μM）的HBSS灌流海馬神經(jīng)元，結(jié)果表明，低濃度的Str（10-8mol/L）引起Ca2+的熒光強度變化的比值是1.060士0.041，高濃度的Str(10-5mol/L)引起Ca2+的熒光強度變化的比值是1.056士0.022，與對照相比二者均可使海馬神經(jīng)元[C

11、a2+]i明顯降低，從而進一步提示Str誘導細胞[Ca2+]i的升高與細胞外鈣的內(nèi)流有關。5細胞內(nèi)鈣釋放對Str誘導的海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣升高的影響
　　 用含有IP3受體阻斷劑2-APB（50μmol/L）的HBSS灌流海馬神經(jīng)元，低濃度的Str(10-8mol/L)引起Ca2+熒光強度變化的比值是1.315士0.0237，與對照組相比無顯著性差異(p＞0.05)，提示低濃度Str引起[Ca2+]i升高與細胞內(nèi)鈣的釋放無關；而高

12、濃度的Str(10-5mol/L)引起Ca2+的熒光強度變化的比值是1.640士0.045(p＜0.01)，與對照相比可使海馬神經(jīng)元[Ca2+]i明顯降低，提示細胞內(nèi)鈣釋放參與了高濃度Str(10-5mol/L)引起[Ca2+]i升高。
　　 6 PKA和PKC信號轉(zhuǎn)導通路與Str誘導的海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣升高的關系
　　 在灌流液加入中PKC信號轉(zhuǎn)導通路阻斷劑CHE(10μmol/L)，低濃度的Str(10-8mol/L

13、)引起Ca2+的熒光強度變化的比值是1.333±0.049，高濃度的Str(10-5mol/L)引起Ca2+的熒光強度變化的比值是1.853士0.024，與對照組相比二者均無顯著性意義(p＞0.05)，提示Str引起[Ca2+]i升高與PKC信號轉(zhuǎn)導途徑無關。在灌流液加入中PKA信號轉(zhuǎn)導通路阻斷劑H89(1μM)，低濃度的Str（10-8mol/L）引起Ca2+的熒光強度變化的比值是1.245±0.029(p＞0.05)，高濃度的Str

14、(10-5mol/L)引起Ca2+的熒光強度變化的比值是1.675±0.047(p＜0.01)，高濃度Str可使海馬神經(jīng)元[Ca2+]i明顯降低，提示PKA信號轉(zhuǎn)導途徑與高濃度Str誘導細胞[Ca2+】i的升高有關。
　　 結(jié)論：Str可劑量依賴性增加大鼠海馬神經(jīng)元細胞[Ca2+】i的升高；谷氨酸受體與Str誘導海馬神經(jīng)元細胞[Ca2+】i無明顯相關性；細胞外鈣的內(nèi)流參與Str誘導細胞[Ca2+]i的升高；細胞內(nèi)鈣可通過IP3受