WNT11在Ⅱ型骨質(zhì)疏松癥發(fā)生中的作用初探——WNT11調(diào)控人骨髓基質(zhì)干細胞的成骨-成脂分化.pdf

1、第一部分、甲狀旁腺激素和雙磷酸鹽治療對骨質(zhì)疏松癥骨密度作用的比較—隨機對照試驗的Meta分析
　　 目的：對于骨質(zhì)疏松癥的治療，雙磷酸鹽和甲狀旁腺激素(PTH)是抗骨吸收藥和促骨形成兩類藥物的代表。骨密度(BMD)是評價骨質(zhì)疏松癥治療效果的必要參考指標。本研究的目的是采用Meta分析方法評價在骨質(zhì)疏松癥治療中，PTH和雙磷酸鹽對于BMD影響的差異。
　　 方法：我們進行了文獻檢索以篩選出研究在骨質(zhì)疏松癥治療中，PTH和雙

2、磷酸鹽對于BMD影響的差異方面的研究。共有7篇文章納入本Meta分析，收集了944例患者的數(shù)據(jù)。
　　 結果：綜合數(shù)據(jù)結果顯示，相對于雙磷酸鹽，PTH治療升高脊柱椎體BMD百分比的功效顯著強于雙磷酸鹽(WMD=5.90，95％ CI:3.69-8.10，p＜0.01)。在髖關節(jié)，相對于雙磷酸鹽，高劑量的PTH(1-34)顯示出更強的升高BMD百分比的功效(股骨頸: WMD=5.67，95％ CI:3.47-7.87，p＜0.01

3、;全髖關節(jié):WMD=2.40，95％CI:0.49-4.31，p＜0.05)，PTH長于12個月的治療也顯示出更強的升高BMD百分比的功效（股骨頸:WMD=5.67，95％ CI:3.47-7.86，p＜0.01;全髖關節(jié):WMD=2.40，95％ CI:0.49-4.31，p＜0.05），而少于12個月的治療顯示出較低的升高BMD百分比的功效（股骨頸:WMD=-1.05，95％ CI:-2.26-0.16，p＜0.01;全髖關節(jié):WM

4、D:-1.69，95％ CI:-3.05-0.34，p＜0.05）。關于橈骨遠端的綜合數(shù)據(jù)分析結果顯示，相對于雙磷酸鹽，PTH顯示出更強的降低BMD百分比的功效(WMD=-3.68,95％ CI:-5.57-1.79,p＜0.01).
　　 結論：和雙磷酸鹽相比，PTH顯示出更強的升高脊柱椎體BMD百分比的效果，在髖部，與雙磷酸鹽比較，PTH升高BMD百分比的效果呈現(xiàn)時間和劑量依賴性。對于橈骨遠端，PTH的治療呈現(xiàn)出比雙磷酸鹽更

5、加降低的BMD百分比。
　　 第二部分、人骨髓基質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)與誘導分化鑒定
　　 目的：利用既往研究已經(jīng)建立的hMSCs的培養(yǎng)方案，建立hMSCs的培養(yǎng)體系并做鑒定，為后續(xù)的實驗研究提供細胞來源。
　　 方法：骨髓樣本取自上海市第六人民醫(yī)院骨科因骨關節(jié)炎行全髖關節(jié)置換手術病人，從手術中分離股骨頭頸中分離獲得。以密度梯度離心法獲得單個核細胞，以貼壁分離方法獲得hMSCs，在含有10％FBS的D-MEM的培養(yǎng)基中

6、培養(yǎng)和傳代擴增。在成骨、成脂肪誘導下培養(yǎng)，分別用ALP活性檢測、茜素紅染色鑒定成骨細胞分化;利用油紅染色鑒定脂肪分化。
　　 結果：原代培養(yǎng)24h部分細胞開始貼壁伸展變形，48-72h后呈紡錘形或梭形，偶見形成集落，培養(yǎng)5-7d后見貼壁生長的細胞增殖迅速，可見多個細胞集落形成，當培養(yǎng)至第12-14d時，細胞已大部分融合，長滿培養(yǎng)皿底，細胞成長梭形（成纖維樣外觀），有的細胞呈交叉重疊生長。一般5-10d可傳一代，細胞可連續(xù)傳4-1

7、4代。成骨細胞誘導分化后可檢測到ALP活性，并見茜素紅染色陽性細胞形成。成脂誘導分化后可見不同形狀的油紅陽性染色細胞形成。
　　 結論：應用本實驗方法從骨髓分離、培養(yǎng)和擴增獲得hMSCs，具有向成骨細胞、脂肪細胞分化的能力。
　　 第三部分、WNT激活劑對人骨髓基質(zhì)干細胞成脂-成骨分化影響的研究
　　 目的：觀察WNT信號通路激活劑SB-216763對于人骨髓基質(zhì)干細胞(hMSCs)成脂-成骨分化的影響。

8、　　 方法：將hMSCs與SB-216763共同培養(yǎng)，以免疫細胞化學染色觀察hMSCs表達β-catenin的變化，以MTT法檢測hMSCs的增殖能力、以油紅染色法檢測hMSCs成脂誘導分化形成的陽性染色細胞的數(shù)目，在成骨細胞誘導分化條件下檢測hMSCs的堿性磷酸酶(ALP)活性。
　　 結果：SB-216763可以顯著促進hMSCs表達β-catenin(30.2±2.7比13.3±2.1，p＜0.01)、顯著促進hMSCs

9、增殖(p＜0.01）、抑制hMSCs向脂肪細胞分化（油紅陽性細胞數(shù):27.4±3.2比8.4±2.1，p＜0.01）、降低hMSCs的ALP活性(p＜0.01)。
　　 結論：SB-216763可以在hMSCs中作為Wnt信號通路的激活分子，激活Wnt信號通路可以促進hMSCs的增殖，抑制hMSCs向脂肪細胞分化并且抑制hMSCs的成骨活性。
　　 第四部分、WNT11對于hMSCs向成骨細胞、脂肪細胞分化的影響

10、　　 目的：作者前期的研究發(fā)現(xiàn)在hMSCs向脂肪細胞分化過程中，WNT11的表達逐漸增強。本實驗擬采用RNAi方法沉默WNT11的表達，研究WNT11在hMSCs向成骨細胞和脂肪細胞分化中的作用。
　　 方法：采用WNT11 shRNA慢病毒載體轉導hMSCs，沉默WNT11的表達，分別誘導hMSCs向成骨細胞和脂肪細胞分化。以油紅染色檢測陽性細胞的數(shù)目，采用茜素紅染色檢測成骨細胞礦化能力，以Q-RT-PCR檢測檢測脂肪細胞和

11、成骨細胞標志基因表達的差異，采用Western immunoblotting檢測WNT11和β-catenin蛋白水平的表達變化。
　　 結果：WNT11表達沉默對β-catenin的表達無明顯影響。和對照組相比，RNAi組的hMSCs成骨誘導分化形成鈣結節(jié)量較多連接成片，成骨細胞礦化相關基因BSP、OC的表達在RNAi組增高。在成脂肪細胞誘導分化條件下，RNAi組的hMSCs形成油紅染色陽性的細胞數(shù)目顯著減少(p＜0.01)，

12、RNAi組的脂肪細胞分化標志基因PPARγ2、Adipson、LPL的表達明顯降低，其中PPARγ2(p＜0.01)、LPL(p＜0.05)的表達降低具有統(tǒng)計學差異。
　　 結論：WNT11沉默后，hMSCs向成骨細胞分化增強，向脂肪細胞分化減弱，提示W(wǎng)NT11可以促進hMSC向脂肪細胞分化，抑制hMSCs向成骨細胞分化。
　　 由本研究，我們得到以下結論:
　　 1、和目前治療骨質(zhì)疏松癥的首選藥物雙磷酸鹽相比，

13、促進骨形成藥物PTH在提高脊柱和髖部BMD方面顯示出優(yōu)勢，提示從WNT信號通路入手開發(fā)新的治療骨質(zhì)疏松癥的促進骨形成的藥物是一條可行之路;
　　 2、通過本實驗室建立的hMSCs的分離和培養(yǎng)方法，可獲得足夠數(shù)量的hMSCs用于實驗，細胞培養(yǎng)體系穩(wěn)定可靠;
　　 3、激活經(jīng)典WNT信號通路可以促進hMSCs的增殖，抑制hMSCs向脂肪細胞分化并且抑制hMSCs的成骨活性;
　　 4、WNT11沉默后，hMSCs向成