骨髓干細胞移植聯(lián)合促紅細胞生成素治療缺血性心血管病的研究.pdf

1、全文分為五部分： 第一部分 骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)和鑒定 目的:優(yōu)化獲取大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenclaymal stem cells，MSC)并對其進行純化、鑒定，同時對其生物學(xué)特性進行研究，為細胞移植治療缺血性心血管病奠定基礎(chǔ)。 方法:采用貼壁篩選法分離純化大鼠骨髓問充質(zhì)干細胞，傳代擴增，觀察細胞形態(tài)。選用第2代骨髓間充質(zhì)干細胞采用MTT法鑒定MSC的增殖和自我更新能力；選用第4代MSC，利用成脂培養(yǎng)基

2、定向誘導(dǎo)MSC分化為脂肪細胞，利用油紅0免疫組化染色鑒定分化后的細胞；采用流式細胞儀觀察細胞表面標志物的表達。 結(jié)果:分離和純化的大鼠MSC呈均勻有序的成纖維細胞樣形態(tài)，出現(xiàn)增殖性生長，能夠被誘導(dǎo)分化為脂肪細胞。經(jīng)流式細胞儀檢測顯示CD44，CD90陽性，CD45，CD34陰性。 結(jié)論:采用貼壁細胞分離法可以得到純化的骨髓MSC，MSC具有高度增殖、自我更新和定向分化為脂肪細胞的能力，而且此方法簡便易行。 第二部

3、分 促紅細胞生成素對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和細胞周期的影響 目的:觀察促紅細胞生成素(Eryrthropoietin，EPO)對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)增殖和細胞周期的影響。 方法:無血清條件下，不同劑量(0,0.25，0.5，1，2，10U/ml)EPO與MSC共培養(yǎng)24小時，MTT方法檢測MSC增殖情況；10U/ml EPO與MSC共培養(yǎng)72小時后，流式細胞儀檢測細胞

4、周期情況。 結(jié)果:MTT結(jié)果表明，EPO呈劑量依賴性促進MSC增殖，除0.25U/ml劑量外，其余各組都與對照組有顯著性差異，以10U/ml EP0促MsC增殖作用最明顯。流式細胞檢測表明，EPO組能降低G0/G1期比例，增加S期和G2/M期細胞比例，與對照組相比，差異均有顯著性意義(P<0.05)。 結(jié)論:EPO可以促進骨髓間充質(zhì)干細胞增殖，并且這種影響呈劑量依賴性。 第三部分 促紅細胞生成素抑制骨髓間充質(zhì)干細

5、胞凋亡、促進旁分泌作用的研究 目的:觀察促紅細胞生成素(Eryrthropoietin，EPO)對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)凋亡和旁分泌血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelial growthfactor，VEGF)的影響。 方法:無血清條件下，不同劑量(0,0.25，0.5，1，2，10U/ml)EPO與MSC共培養(yǎng)24小時，ELISA方法檢測MSC分泌V

6、EGF情況；2U/ml EPO、2U/ml EPO加50nM wortmannin或單純培養(yǎng)液在無血清情況下與MSC共培養(yǎng)24小時后，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。 結(jié)果:EPO能顯著減少無血清條件下的細胞凋亡，wortmannin部分抑制了EPO抗細胞凋亡能力(P<0.05)。EPO培養(yǎng)條件下，MSC分泌的VEGF明顯增加。VEGF濃度和EPO劑量之間存在劑量依賴性關(guān)系。 結(jié)論:EPO可以抑制骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡，增加其

7、旁分泌作用。 第四部分 骨髓間充質(zhì)干細胞移植聯(lián)合促紅細胞生成素應(yīng)用對大鼠心肌梗死的影響 目的:促紅細胞生成素通過PI3K/AKt途徑誘導(dǎo)血管生成和抑制細胞凋亡。骨髓間充質(zhì)干細胞移植可以改善心肌缺血后心臟灌注和提高心功能。本研究探討EPO能否增加MSC移植效果。 方法:32只Wistar大鼠隨機分為心肌梗死組(MI)、EPO組(EPO)、骨髓間充質(zhì)干細胞移植組(MSC)和聯(lián)合治療組(MSC-EPO)，永久結(jié)扎左冠狀

8、動脈前降支制備心肌梗死模型。通過局部注射的方法將培養(yǎng)的大鼠自體骨髓MSC移植入梗死區(qū)，EPO組及聯(lián)合治療組圍手術(shù)期每天腹腔注射EPO(3000 IU/kg)，共3d，14 d后再連續(xù)注射3 d，術(shù)后2 d及21 d二維超聲心動圖檢測心功能。術(shù)后2l d Western blot和免疫組化檢測評價治療效果。 結(jié)果:術(shù)后21 d MI組心功能較術(shù)后2 d明顯惡化，而其余3組明顯改善，其中尤以聯(lián)合治療組改善最為明顯。術(shù)后21 d，MS

9、C-EP0組與其他3組相比較，心肌梗死面積明顯減??；免疫組化顯示毛細血管密度顯著增加、Bcl-2明顯上調(diào)而Bax明顯下調(diào)；Western blot顯示：磷酸化AKt與總AKt比值明顯上升。MSC組以及EPO組與MI組之間比較有統(tǒng)計學(xué)差異。MSC在體內(nèi)能分化為內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和心肌樣細胞。 結(jié)論:MSC移植和EPO注射都可以改善心肌梗死后心功能。EPO增強了MSC移植在大鼠心肌梗死后促血管形成及改善心功能作用；EPO的這種治療

10、作用部分通過其自身的促血管形成作用、抗心肌細胞凋亡、促進干細胞增殖作用來介導(dǎo)的。 第五部分 促紅細胞生成素增強骨髓間充質(zhì)干細胞治療下肢缺血作用 目的:骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)和促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)都有促血管生成和保護缺血器官的作用。本研究觀察聯(lián)合MSC和EPO是否有協(xié)同改善小鼠下肢缺血功能的作用。 方法:結(jié)扎股動脈造成下肢缺血模型，

11、隨機分為4組：MSC組、EPO組、MSC-EPO組和對照組。MSC組和MSC-EPO組在下肢缺血后一天移植3×10<'6>綠色熒光小鼠源骨髓MSC，EPO組和MSC-EPO組在下肢缺血后一天皮下連續(xù)注射7天EPO(5000u/Kg/d)。治療后1，3，7天ELISA法檢測缺血下肢VEGF水平。缺血后21天，激光多普勒檢測下肢血流恢復(fù)情況，病理標本檢查組織學(xué)和毛細血管密度，激光共聚焦檢測移植MSC分化情況。 結(jié)果:與對照組相比，單

12、獨MSC或EPO治療都明顯增加缺血下肢VEGF表達(P<0.05)，聯(lián)合MSC和EPO能進一步促進VEGF表達(P<0.05)。治療后21天，與對照組比較，MSC或EPO組缺血下肢血流明顯改善(P<0.05)，毛細血管密度也顯著增加(P<0.05)；而聯(lián)合治療組缺血下肢血流和毛細血管密度明顯高于單獨治療組(P<0.05)。激光共聚焦檢測顯示移植的MSC能分化為內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞。 結(jié)論:聯(lián)合MSC和EPO較單獨MSC移植能進一