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文檔簡介
1、研究背景:系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種臨床表現(xiàn)多樣,可累及多個系統(tǒng)、多個臟器的自身免疫性疾病。本病好發(fā)于青年女性,發(fā)病高峰為15~40歲,男女發(fā)病比例為1∶9左右。全球的患病率約為30~50/10萬人,據(jù)我國流行病學(xué)的初步統(tǒng)計,我國的患病率約為70/10萬人-100/10萬人,且有逐年增多的趨勢。SLE發(fā)病機制目前尚未完全闡明,可能與遺傳、環(huán)境、性激素等因素有關(guān),但B細胞過度活化和自身抗體的產(chǎn)生在SLE發(fā)病中起了重要作用,機體產(chǎn)生的這
2、些自身抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物,免疫復(fù)合物沉積于皮膚、血管、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)等處,進而引起多組織及多器官的損害。SLE的臨床表現(xiàn)多種多樣:表現(xiàn)有反復(fù)高熱或長期低熱,脫發(fā),關(guān)節(jié)腫脹疼痛,皮膚可出現(xiàn)面頰部蝴蝶形紅斑或盤狀紅斑,累及口腔粘膜時出現(xiàn)點狀出血、糜爛或潰瘍等,并且還可侵犯胸膜、心臟、腎臟,對神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等均可造成損害。當(dāng)累及神經(jīng)精神系統(tǒng)稱之為神經(jīng)精神狼瘡(NPSLE),是SLE病情嚴(yán)重的一種表現(xiàn),且病死率高。N
3、PSLE臨床表現(xiàn)多樣,可發(fā)生在SLE任何時期,且其發(fā)病機制不清楚,但近年來大量學(xué)者發(fā)現(xiàn)自身抗體可能與NPSLE發(fā)病機制相關(guān)。但目前國內(nèi)外對NPSLE診斷標(biāo)準(zhǔn)仍不完善,且缺乏早期預(yù)測和診斷NPSLE實驗室診斷方法。
自身抗體的實驗室檢測已成為SLE診斷的重要依據(jù)之一,抗Sm抗體、抗磷脂抗體、抗核抗體、抗DNA抗體已被納入1997年美國風(fēng)濕病協(xié)會(ARA)修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)中。但SLE是一種多種自身抗體參與的免疫性疾病,許多
4、新的可能參與SLE甚至NPSLE發(fā)病的自身抗體被越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)。
抗Sm抗體是1966年Tan從名為Smith的患者血清中發(fā)現(xiàn)的一種SLE標(biāo)志性抗體,是SLE患者的血清特異性標(biāo)志,在SLE患者血清中陽性率為21%-30%,其對SLE診斷特異性很高,但敏感性較低。已證實抗Sm抗體的水平與SLE疾病活動程度及臨床表現(xiàn)沒有相關(guān)性,但是,抗Sm抗體的檢測對早期、不典型的SLE或治療后的回顧性診斷具有很大幫助。目前對抗Sm抗體
5、的檢測常用的有免疫擴散法(ID)、免疫印跡法(IBT)及免疫電泳法(CIE)三種方法,目前醫(yī)院多以IBT作為抗Sm抗體的主要檢測方法。但IBT法對于抗Sm抗體的檢測敏感性較高而特異性較低,主要原因在其結(jié)果判定時準(zhǔn)確性不夠,目前多數(shù)IBT法以出現(xiàn)28KD、29KD、13.5KD條帶作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn),但Sm抗原具有多種異構(gòu)體成分多肽,抗Sm抗體的不同一性,與不同的Sm抗原決定簇或成分多肽親和力不同,以不同條帶作為抗Sm抗體陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)將影響
6、IBT法對抗Sm抗體檢測的陽性率。
抗心磷脂抗體(ACA)是抗磷脂抗體中的一種,可結(jié)合于紅細胞、血小板和內(nèi)皮細胞等細胞膜上帶負電荷的磷脂,造成紅細胞、血小板和內(nèi)皮細胞等細胞受損,進而導(dǎo)致血栓形成、血小板減少等損害,大量研究證實ACA在動靜脈血栓、血小板減少、自發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生機制中起重要作用。ACA可見于SLE或其他結(jié)締組織病,但以SLE患者中陽性率最高,可達30%-40%,研究發(fā)現(xiàn)ACA陽性與SLE患者血小板減少、血栓形成
7、、血管炎以及神經(jīng)系統(tǒng)病變有關(guān)。
抗核糖體P蛋白抗體(ARPA)為針對核糖體P蛋白c末端區(qū)的抗體,主要針對60 s核糖體亞單位磷酸蛋白P0、P1、P2,近年來有大量報道證實抗核糖體P蛋白抗體只存在SLE患者中,為SLE特異性抗體,且對SLE診斷特異性很高,是繼抗Sm抗體、抗DNA抗體后發(fā)現(xiàn)的另一SLE特異性抗體。早期僅發(fā)現(xiàn)ARPA在SLE神經(jīng)系統(tǒng)病變中發(fā)揮重要作用,其與嚴(yán)重抑郁、癲癇、癡呆、橫貫性脊髓損傷、無菌性腦膜炎等神經(jīng)
8、精神性狼瘡(NPSLE)臨床癥狀的出現(xiàn)相關(guān),且滴度與精神病、抑郁的嚴(yán)重程度、臨床病程相關(guān),現(xiàn)發(fā)現(xiàn)ARPA與SLE病情活動度、血小板減少及腎臟損害亦相關(guān),可作為SLE病情活動程度的評價指標(biāo)。
抗N-甲基-D-天冬氨酸受體抗體(抗NMDA受體抗體),是針對NMDA受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor)的一種抗體。NMDA受體是一種中樞谷氨酸鹽興奮性受體,其在整個腦神經(jīng)細胞都有表達,并對于神經(jīng)
9、突觸形成、神經(jīng)元發(fā)育、神經(jīng)細胞移行等發(fā)揮重要作用,且影響學(xué)習(xí)和記憶等多種生理過程??筃MDA受體抗體透過血腦屏障與NMDA受體結(jié)合后,可引起神經(jīng)元凋亡,進而出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常;并可通過與海馬神經(jīng)元的結(jié)合,出現(xiàn)記憶、學(xué)習(xí)等認(rèn)知功能障礙。已有大量研究證實抗NMDA受體抗體參與NPSLE的發(fā)病機制,與NPSLE患者情緒低落、短期記憶學(xué)習(xí)能力下降、認(rèn)知功能障礙的臨床表現(xiàn)有關(guān)。
抗神經(jīng)元抗體(Anti-neuronal antib
10、ody, anti-NA)常見為IgG和IgM型,由多種不同抗原成分的抗體組成,大致可分為抗神經(jīng)細胞膜抗原和抗神經(jīng)細胞質(zhì)抗原的抗體??股窠?jīng)元抗體可結(jié)合于神經(jīng)細胞,促進分泌細胞因子,繼而發(fā)生炎癥反應(yīng),導(dǎo)致廣泛的神經(jīng)組織損傷。有研究者在有神經(jīng)系統(tǒng)損害的SLE患者血清及腦脊液中發(fā)現(xiàn)抗神經(jīng)元抗體,所以推測抗神經(jīng)元抗體可能參與NPSLE發(fā)生機制中,隨著對抗神經(jīng)元抗體深入研究,沒有發(fā)現(xiàn)抗神經(jīng)元核抗體(抗-Hu,抗-Yo,抗-Ri)在NPSLE的發(fā)生
11、機制發(fā)揮作用,而發(fā)現(xiàn)抗神經(jīng)元抗體(IgG型)與NPSLE的神經(jīng)精神癥狀相關(guān)。
目前對于ACA及ARPA的檢測多采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),因其操作簡單方便,且可定量檢測抗體水平,故廣泛應(yīng)用于臨床實驗室中。而抗NMDA受體抗體及抗神經(jīng)元抗體(IgG型)目前尚無成熟的實驗室檢測方法,一些文獻采用體外合成一段肽鏈作為抗原建立間接ELISA法檢測抗NMDA受體抗體,但各研究者使用的陽性對照并不相同,有研究者以預(yù)實驗中強陽性患
12、者的標(biāo)本作為陽性對照,有研究者利用單克隆抗體作為陽性對照,前者的實驗準(zhǔn)確性有所降低,而后者應(yīng)用于臨床實驗室中會增加檢測費用。對于抗神經(jīng)元抗體的檢測方法有免疫熒光法、免疫放射標(biāo)記法等,大多數(shù)學(xué)者采用人神經(jīng)母細胞瘤瘤系細胞作為抗神經(jīng)元抗體的來源細胞,免疫熒光法其原理是用熒光抗原標(biāo)記物檢測相應(yīng)抗體,因其免疫熒光非特異性染色問題尚未完全解決,結(jié)果判定客觀性不足,并且技術(shù)程序比較復(fù)雜臨床較少使用,而免疫放射標(biāo)記法也存在不足,其是利用同位素標(biāo)記抗原
13、從而追蹤抗體,故此方法有引起實驗者輻射損傷的可能,并且該實驗易出現(xiàn)交叉反應(yīng)、假陽性反應(yīng)等,也不是臨床實驗室的首選檢測方法。所以對于建立和完善抗NMDA受體抗體及抗神經(jīng)元抗體(IgG型)實驗室檢測方法,進一步研究其與NPSLE相關(guān)性對于診斷及預(yù)防NPSLE具有重要意義。
目的:
1.完善或建立抗NMDA受體抗體及抗神經(jīng)元抗體(IgG型)實驗室檢測方法。
2.研究SLE患者血清中ACA、ARPA、抗
14、NMDA受體抗體及抗神經(jīng)元抗體等四種自身抗體的表達水平及其與SLE疾病活動度的關(guān)系,進一步評價四種抗體在SLE尤其是NPSLE臨床診斷中的應(yīng)用價值。
3.建立免疫擴散法檢測SLE患者血清中抗Sm抗體,評價目前臨床常用的免疫印跡法檢測抗Sm抗體的敏感性和特異性。
研究方法:
1、采用夾心ELISA法試劑盒分析30例SLE患者(包括活動期SLE患者組21例和非活動期SLE患者組9例),30例正常人血
15、清及2例NPSLE患者腦脊液中ACA、ARPA兩種抗體的水平。
2、以體外合成的肽抗原(Ac-WEYSvwL-SN-NH2)作為抗原建立間接ELISA法檢測30例SLE患者(包括活動期SLE患者組21例和非活動期SLE患者組9例),30例正常人血清及2例NPSLE患者腦脊液中抗NMDA受體抗體的水平。
3、以人神經(jīng)上皮瘤細胞株(SK-N-MC)作為抗原建立細胞-ELISA法檢測30例SLE患者(包括活動期SL
16、E患者組21例和非活動期SLE患者組9例),30例正常人血清及2例NPSLE患者腦脊液中抗神經(jīng)元抗體(IgG型)的水平。
4、以兔胸腺丙酮粉浸出液作為抗原建立免疫擴散實驗,同時用免疫印跡法檢測32例SLE患者(包括活動期SLE患者組22例和非活動期SLE患者組10例),30例正常人血清中抗Sm抗體。
應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,正態(tài)分布計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述,兩樣本間的比較采用兩樣本均數(shù)的t檢驗;當(dāng)滿
17、足方差齊性時,各組均數(shù)間的多重比較使用LSD方法進行分析:當(dāng)不滿足方差齊性時使用近似F檢驗(Welch方法)進行分析,各組均數(shù)間的多重比較使用校正的多重比較方法(Dunnett'S T3)進行分析。完全隨機設(shè)計的兩樣本率的比較用x2檢驗,配對設(shè)計的兩樣本率的比較用McNemar檢驗,非參數(shù)數(shù)據(jù)的相關(guān)分析用Spearman秩相關(guān),一致性檢驗用Kappa檢驗。以P<0.05視為有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果:
1、ACA和
18、ARPA在活動期SLE患者組血清中的表達水平及陽性率均顯著高于非活動期SLE患者及正常對照組,且ACA、ARPA與SLE病情活動程度呈正相關(guān),在伴有血小板減少、皮疹、蛋白尿等癥狀的SLE患者中ACA檢出率高,而ARPA僅與SLE患者出現(xiàn)皮疹、蛋白尿臨床表現(xiàn)相關(guān);在SLE患者中同時檢測ACA和ARPA與單獨檢測ACA和ARPA對SLE的診斷價值比較無統(tǒng)計學(xué)意義。
2、抗NMDA受體抗體及抗神經(jīng)元抗體在活動期SLE患者血清中的
19、水平均高于在正常對照組,但活動期SLE患者組與非活動期SLE患者組比較無統(tǒng)計學(xué)意義,它們與SLE患者血小板減少、皮疹、關(guān)節(jié)炎、蛋白尿臨床表現(xiàn)無關(guān)。
3、2例被診斷為NPSLE的患者血清及腦脊液中ARPA、抗NMDA受體抗體及抗神經(jīng)元抗體均陽性,經(jīng)有效治療(1例使用甲基強的松龍1.0g靜脈灌注連續(xù)治療3天,1例使用氨甲喋呤5mg+地塞米松5mg鞘內(nèi)注射治療)癥狀緩解病情穩(wěn)定后,患者血清ARPA仍陽性,但滴度明顯降低,而抗NM
20、DA受體抗體及抗神經(jīng)元抗體均轉(zhuǎn)陰性,相反在腦脊液中三種抗體仍為陽性,但滴度明顯降低。
4、比較免疫擴散法與免疫印跡法檢測SLE患者血清中抗Sm抗體的結(jié)果一致性較差(Kappa=0.321),其兩者陽性率比較有統(tǒng)計學(xué)意義,相比免疫擴散法,免疫印跡法檢測抗Sm抗體敏感性更高而特異性較低。
結(jié)論:
1、ACA、ARPA、抗NMDA受體抗體及抗神經(jīng)元抗體均可作為SLE診斷的血清學(xué)依據(jù),且ACA、ARPA
21、與SLE病情嚴(yán)重程度相關(guān),可作為判斷SLE治療效果的指標(biāo);
2.ACA與SLE患者出現(xiàn)血小板減少、皮疹、蛋白尿臨床表現(xiàn)相關(guān),ARPA與SLE患者出現(xiàn)皮疹、蛋白尿臨床表現(xiàn)相關(guān),抗NMDA受體抗體及抗神經(jīng)元抗體與SLE患者血小板減少、皮疹、關(guān)節(jié)炎、蛋白尿臨床表現(xiàn)無關(guān);
3.2例診斷為NPSLE的患者在有效治療前后其腦脊液中ARPA、抗NMDA受體抗體及抗神經(jīng)元抗體均陽性,但治療后滴度明顯下降,而血清中抗NMDA受
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